《Journal of Advanced Research》
影响因子：10.479
派森诺与浙江理工大学植物次生代谢创新团队许玲老师课题组合作在国际知名期刊《Journal of Advanced Research》在线发表了题为“Insights into the plateau adaptation of Salvia castanea by comparative genomic and WGCNA analyses”的研究论文。该研究首次通过比较基因组分析揭示了栗色鼠尾草的起源与进化，阐明了栗色鼠尾草在1600万年前青藏高原形成过程中，与栽培丹参开始了物种的分化；并通过RNA-seq和WGCNA分析阐明了栗色鼠尾草高原适应性的机理。
研究背景
鼠尾草是一种野生植物，适应青藏高原（QTP）极端环境。由于富含丹参酮 IIA (T-IIA)成分，鼠尾草也被用于药用。尽管它对中药工业很重要，但该物种中次生代谢物（即 T-IIA 和迷迭香酸 (RA)）积累相关的机制、以及鼠尾草特殊地下组织在QTP 适应中的作用机制仍然未知。本文通过探索鼠尾草地下茎中心的类周皮结构现象，揭示该物种QTP适应的分子进化机制，为后续栽培丹参的遗传改良提供重要参考。
研究材料与方法
实验材料
2020 年 11 月采集于中国云南省丽江市玉龙雪山地区的一年生和多年生鼠尾草野生样品。1979年至2020年的气象资料来自于靠近采样点的玉龙纳西族自治县。对于物种进化和高次生代谢物积累的分析，将样品分成不同的组织（根、茎、叶和叶柄），立即将其浸入液氮中进行进一步的 PacBio SMRT 测序分析。收集一年生和多年生植物的叶、周皮、韧皮部和木质部组织，共收集八种组织用于二代测序和活性成分分析，三个生物重复。
测序平台
Illumina NovaSeq、PacBio SMRT
分析内容
对栗属植物进行形态学观察和全长转录组研究。鼠尾草与其他14个代表性物种的比较基因组分析用于揭示其系统发育位置和分子进化机制。应用RNA-seq和WGCNA分析来了解鼠尾草组织中T-IIA和RA高积累的机制。
研究结果
R1：形态学和地下茎特殊发育模式
本研究中使用的鼠尾草种生长于玉龙山区，长椭圆形叶基生，上下表面密被绒毛。在开花季节，四边形茎会从基生叶和开花的鼠尾草轮枝上抽薹，花的上唇也有浓密的绒毛。这些特点对高原环境的适应做出了很大贡献。有趣的是，而该物种的地下形态很特殊，因为树木的多枝收缩并埋在地下，根据形态外观，很难区分地下茎和主根。然而，从一年生根的横截面可以清楚地看到地下茎的自下而上的分化，其中心部分逐渐分裂，生成周皮样组织，包围新生成的组织，在地下茎中间留下中空结构。在发育过程中，中心部分径向分成几个对称的小“分支”，具有独立的木质部结构。周皮可能作为一层外衣或盔甲，紧紧围绕着新生成的树枝状结构，并随着地下茎的发育而不断再生。石蜡断面散开较多细枝状结构，地下茎自下而上分化。因此，本研究首次提出了“地下树干--树枝发育模型”，该模型很好地解释了栗色鼠尾草地下茎内部周皮样组织的成因。
图1：鼠尾草地下茎的形态特征及发育模型
R2：比较基因组学分析
基于鼠尾草以及公共数据库下载的14个代表性植物基因组，利用比较基因组学分析共确定了212个单拷贝OGG用于物种系统发育树构建。结果表明鼠尾草是丹参的近源，大约在1600万年前与丹参分离。扩张与收缩分析发现栗色鼠尾草在植物干细胞CLV-WUS逆反馈回路上拥有LRR结构域等直系同源基因群的特异性扩增，并鉴定出24个特有基因，尤其是2个细胞程序性死亡基因；有趣的是，特有OGG的GO分析显示：韧皮部或木质部组织发生、韧皮部枝条发育只在收缩的5750个OGG涉及。因此，收缩的OGG可能有助于鼠尾草形成特定的地下茎结构。
同时还筛选出具有特殊DNA损伤修复、抗氧化等功能的64个正选择基因，其中3种与PSG相关的氧化还原酶活性和3种与PSG相关的磷酸酶活性对于调节 ROS 至关重要。这些结果表明，鼠尾草中的PSG（PAC和CHLM）复杂的调控网络，共同实现了栗色鼠尾草独特的地下茎形态以适应高原强紫外线、低氧、低温等极端特殊生境。
图2：比较基因组分析的鼠尾草系统发育及其 QTP 适应机制
R3：地下茎形成的潜在机制与参与鼠尾草的 QTP 适应的基因
RNA-seq分析发现鼠尾草CLV-WUS逆反馈回路上WOX8基因的稳定表达对维持其干细胞稳态利于特殊地下茎形态的形成发挥了关键作用。此外植物激素如负责生长素运输的PIN1A基因在木质部中显著上调；ABA 信号通路中 ANXD1基因在根组织中被诱导；独脚金内酯相关基因（MAX1）和根发育相关基因（PMTT和REV1）在木质部中高表达，表明它们在调节地下茎形态发生中的关键作用。基于此本文提出了一个CLV-WUS 负反馈环和植物激素生长素所揭示的复杂的网络来调节鼠尾草地下茎的形态发生。
此外47个丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）在8个组织中大多都高表达；冷适应相关基因RCI2A1和RCI2A2在多年生周皮、韧皮部和木质部组织中显着上调；DNA损伤修复相关基因DR100a和DR100b在叶中均被抑制。因此，上述结果表明鼠尾草的QTP适应受一个复杂的网络调节，包括 MAPK 信号转导、冷适应反应、DNA 损伤修复和泛素化过程。
图3：鼠尾草地下茎发育和高原适应关键基因的表达谱分析
R4：参与丹参酮生物合成的基因
四种丹参酮主要分布在地下组织中，周皮部含量均显著高于其他组织。大多数与鼠尾草中丹参酮生物合成途径（MVA和MEP）相关的基因都高度表达。四种丹参酮共有相关的103 个基因中有63个TF基因，其中WRKY家族的成员数最多，都与丹参酮含量呈负相关。通过WGCNA分析共确定了29个模块，黑色模块（454 个基因）显示出最强的相关性，其中有五个hub基因与丹参酮生物合成相关。同时，筛选到5个关键TF（如WRK75，HSFB3等)，与调节丹参酮生物合成的其他基因相互作用。
图4：鼠尾草丹参高丹参酮积累的机制
R5：参与迷迭香酸生物合成的基因
一年生叶中的迷迭香酸（RA）含量达到90.94 mg g-1，显著高于其他组织。多年生植株中叶片中的SAB 最高。RNA-seq表明多个基因在鼠尾草RA生物合成途径的每一步中都高表达。苯丙氨酸解氨酶 (PAL) 是RA代谢途径的第一个酶，对15个物种中的PAL基因的系统发育分析表明鼠尾草中PAL基因的数量与丹参中的一致，表明丹参和鼠尾草的PAL基因可能在进化上是保守的，在物种分化后仍发挥着相似的作用。WGCNA分析确定261个基因与 RA 的积累显著相关，其中55个基因是TF基因，且大多数TF与 RA 积累呈正相关；只有61个基因与SAB积累显著相关。通过以上分析实现了该植物中次生代谢物质丹参酮和迷迭香酸的高积累，为后续栽培丹参的遗传改良提供重要参考。
图5：栗色鼠尾草中高RA积累的机制
研究结论
鼠尾草是一种生长在QTP上的野生资源。本文组装了该物种的高质量全长转录组，并揭示它从16 Mya左右的中国模式药用植物丹参中分支出来。基于解剖学观察，我们提出了“树干-分枝”发育模型来解释鼠尾草地下茎中心的周皮样结构。在进化过程中，直系同源基因组显著扩大，24个物种特异性基因和64个正选择基因有助于鼠尾草的形态发生和QTP适应。RNA-seq和WGCNA分析了鼠尾草中两种次生代谢物(T-IIA和RA)高积累的潜在机制，并将 NAC29和 TGA22 确定为关键转录因子。总体而言，鼠尾草特殊的地下茎结构和次生代谢提供了对QTP适应机制的深入了解，并进一步为栽培丹参的遗传改良提供了一些候选基因。
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