简化基因组测序助力桦木属硕桦组物种鉴定与划分

《Annals of Botany》

影响因子：4.357

派森诺与山东农业大学王年课题组在《Annals of Botany》发表了题为Molecular and morphological analyses clarify species delimitation in section Costatae and reveal Betula buggsii sp. nov. (sect. Costatae, Betulaceae) in China 的新研究成果！研究综合多种方法澄清了桦木属硕桦组（Costatae）种间界限，并发表了硕桦组一新物种Betula buggsii （秦巴桦）。该研究进一步丰富了我国桦木属种质资源，为该属种质资源的收集和保护奠定了基础。

研究背景

桦木广泛分布在北半球，是森林生态系统重要组成成分，极具生态价值和经济价值。桦树属（桦树科）是一个具有许多分类学挑战的属。包括大约65个物种和亚种，此外由于广泛的形态变异、频繁的种间杂交和多倍化，桦木属种间分类一直困扰着分类学家。

为了应对这些挑战，在本研究中采用综合方法，结合多种形态学和遗传学方法，解决了桦树属硕桦组的分类不确定性。将形态学、分子[微卫星基因分型、核内转录间隔区（ITS）测序和限制性位点相关DNA测序（RAD-seq）]与倍性分析（流式细胞）相结合，以解决硕桦组内的分类学问题。例如，微卫星标记可以有效地检测最近的种群分化，而RAD-seq可以有效地推断最近分化物种的系统发育关系。倍性水平可以作为生殖隔离的良好指标，尤其是二倍体和四倍体。基于多方面的证据，本文提出了一种修正的方法来处理桦木属硕桦组内的物种边界。 

研究材料与方法

1.实验材料

2018年-2021年在原生境采集树枝样本。基于地理分布和形态分类，收集桦木属硕桦组（Costatae）二倍体、四倍体共计5种10个亚群的样本，包括糙皮桦（糙皮桦亚种[B. utilis ssp. utilis]和红桦亚种[B. utilis ssp. albosinensis]）、岳桦（B. ermanii）、硕桦（B. costata）和B. ashburneri，以及“二倍体”红桦（B. albosinensis [DA]）。Ashburner和McAllister主编的桦木属分类专著记载的糙皮桦（简称B. utilis [AM]）和我国植物志记载的糙皮桦（B. utilis [FC]）。

2.测序策略

简化基因组测序（RAD-seq）

3.分析内容

形态测定、基于RAD-seq的群体进化分析（PCA、进化树、遗传结构）、ITS的系统发育分析等。

研究结果

形态测定分析

使用GPA对地标进行校准，并对“二倍体”红桦、 红桦亚种、国外记载糙皮桦、我国记载糙皮桦、硕桦、岳桦的叶片形状变化进行PCA分析，结果岳桦（B. ermanii）和硕桦（B. costata）的重叠程度要小很多。其中PC1表示的形状变化主要受叶长和叶宽的影响。

图1  植物叶片形态变异的主成分分析（PCoA）

基于简化基因组&SSR的群体结构分析

基于RAD-seq测序数据得到的所有SNP进行PCA分析，同时基于15个SSR的结果也进行PCA分析，基于SSR的PCA结果显示聚成五个簇，前三变异率占总43.8%。结果中红桦亚种分为两组：I组与国外糙皮桦基本重合，而II组与所有其他物种分离。基于SNP的PCA分析结果与基于微卫星标记的PCoA一致，支持了红桦亚种分为2组，且 II组和硕桦分离，且这两种同时与其余物种也分离。

图2  基于82137 SNPs和15个微卫星的PCA与群体结构分析

基于简化基因组测序和ITS的系统发育树构建

倍性研究表明红桦亚种II组和我国糙皮桦为二倍体，其余物种为四倍体。基于ITS的系统发育树显示，B.buggsii样本形成了一个单独聚类，表明该物种同桦木属其它物种存在明显差异，即非已发表的桦木属其他种。基于2,285,620个SNPs的系统发育树显示，红桦II类形成了一个支持率为100%的单系分支，为系统发育单系。综合ITS和SNPs的数据结果推测红桦II类可能为一个疑似新物种。

图3 基于ITS序列（A）和SNP（B）的桦木属系统发育关系。蓝色标注的为秦巴桦（B. buggsii）

新物种秦巴桦的确定

形态学结果表明红桦树皮呈块状剥落，而该疑似新物种树皮呈条状剥落（形态差异）；基于ITS的系统发育结果表明，该疑似物种聚为一支，非已发表的桦木属其它物种；核基因组系统发育表明该疑似新物种的个体聚为单系（系统发育单系）；流式细胞仪以及基于杂合SNP位点推测的结果表明该疑似新物种为二倍体，而红桦为四倍体（生殖隔离）；基于SNP及微卫星标记的结果一致表明，该疑似新物种同硕桦组其它物种存在明显的遗传分化，且不存在遗传混合（非杂交个体）。

综上所述我国桦木属硕桦组可以分为六个种和亚种：Betula ashburneri、硕桦（B. costata）、岳桦（B. ermanii）、糙皮桦（B. utilis ssp. utilis）、红桦（B. utilis ssp. albosinensis）及秦巴桦（B. buggsii）。

图4  桦木属硕桦组种间界定示意图（A）及物种间区分标准（B）。

研究结论

物种划分已从使用单一标准的研究转向使用多种方法综合研究。随着先进测序技术的迅速出现，虽然基因组数据在解决复杂物种关系方面越来越强大，但多种标记共同辅助分组会更好。

本文综合以下标准定义新物种秦巴桦（B. buggsii）：第一，形态差异性（形态学物种概念）；第二，系统发育单系（系统发育物种概念）；第三，同近缘种的生殖隔离（生物学物种概念）；第四，非杂交个体；第五，排除为已发表的其它桦木属物种的可能性。进一步丰富了我国桦木属种质资源，为该属种质资源的收集和保护奠定了基础。

本研究的简化基因组测序（RAD-seq）和群体进化的数据分析由上海派森诺生物科技有限公司完成。如需进一步讨论，欢迎发邮件或者致电我们哟（邮箱地址：[e-mail]，联系电话：[phone]）！

文章索引：Wang LW, Ding JY, Borrell JS,et al. (2021). Molecular and morphological analyses clarify species delimitation in section Costatae and reveal Betula buggsii sp. nov. (sect. Costatae, Betulaceae) in China.Front. Cell. Infect. Ann Bot. 2022 Mar 23;129(4):415-428. doi: 10.1093/aob/mcac001.