【干货分享】CRISPR检测新动向-CRISPR/Cas12a单管检测猴痘病毒

本期继续给大家带来CRISPR检测干货分享，让我们一起看看这期CRISPR检测又有哪些最新的研发进展呢？

一、CRISPR/Cas13a助力丁型肝炎病毒RNA检测

丁型肝炎病毒（HDV）的感染加速了慢性乙型肝炎病毒（HBV）的感染，给患者带来了巨大负担。目前HDV RNA仍缺乏准确和便携的检测方法。本文使用CRISPR-Cas13a技术建立了一种方便、快速、高灵敏度和特异性的方法来检测 HDV RNA。

本文建立了基于CRISPR-Cas13a结合RT-PCR和RT-RAA的荧光和侧向层析检测，分别用于HDV RNA检测。我们对144名HDV-IgG阳性患者进行了一项队列研究，以评估 CRISPR-Cas13a与RT-qPCR和数字PCR相比在识别临床样本HDV方面的诊断性能。

对于合成的HDV RNA质粒，基于RT-PCR-CRISPR的荧光检测的灵敏度为1拷贝/μL；对于HDV RNA阳性样品，基于RT-RAA-CRISPR的荧光和侧向层析试纸测定的灵敏度为10拷贝/μL，与RT-qPCR和RT-ddPCR一样，检测时间仅约85 min。

本文开发的这种高灵敏度和特异性，以及一种便携式和简单的基于CRISPR的检测方法用于检测HDV RNA，这可能是监测HDV感染发展和评估治疗效果的前瞻性措施。

  

                       图1.基于CRISPR-Cas13a HDV RNA检测原理示意图

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二、RPA-Cas12a单管检测猴痘病毒

猴痘是由一种人畜共患病毒引起的，属于正痘病毒属和痘病毒科。在这项研究中，我们开发了一种针对猴痘病毒的重组聚合酶扩增 （RPA） 偶联 CRISPR-Cas12a 检测法。设计并测试了一系列CRISPR衍生的RNA（crRNA），靶向正痘病毒的保守D6R和E9L基因以及猴痘病毒特异的N3R和N4R基因。D6R crRNA-1 在检测正痘病毒方面表现出最强的活性，N4R crRNA-2 能够将猴痘病毒与其他正痘病毒区分开来。单独使用Cas12a/crRNA检测的检测限为10⁸ 拷贝，而偶联 RPA 可以将检测限提高到1-10拷贝。因此，单管 RPA-Cas12a 检测可以在 30 分钟内检测低至1拷贝的DNA病毒 ，并有望为猴痘病毒感染提供即时检测。

  

图2. RPA-Cas12a单管检测猴痘病毒

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三、CRISPR/Cas12a检测鼠伤寒沙门氏菌

在传统的基于CRISPR的生物传感器中，切割诱导产生的信号是不够的，因为在CRISPR诱导的切割过程中只产生一个信号。因此，本文开发了一种基于CRISPR/cas12a生物传感器，扩大了信号的产生，集成了杂交链反应（HCR）和低背景共振能量转移（FRET）信号输出模式。将具有核酸自组装能力的HCR作为信号载体，装载更多的信号分子。为了增加信号的放大，对FAM和Cy5产生的荧光信号输出模式（荧光恢复、FRET和低背景FRET）进行了充分的研究和比较。结果表明，在最严格的信号产生条件下的低背景FRET信号输出模式产生了最高的信噪比（S/N）（19.17），荧光颜色变化最明显，在此条件下，所提出的生物传感器成功地应用于鼠伤寒沙门氏菌检测，检测6小时（包括样品预处理4小时）到最终检测出结果。依赖于颜色变化的定性灵敏度为10³ CFU/ mL。该生物传感器具有优异的检测性能，使其在食品和环境安全监测中具有巨大的应用潜力。

  

图3.基于CRISPR Cas12a生物传感器利用HCR和FRET检测鼠伤寒沙门氏菌

艾迪基因专注于发展和优化基于CRISPR/Cas的基因组编辑技术，技术团队通过自主开发的Fish-bait纯化工艺，获得了性能更好的Cas12和Cas13基因编辑蛋白，并开发了特有的crRNA设计逻辑。由此建立了FASST检测技术，大大提高了Cas酶切割活性和CRISPR检测的灵敏度。

参考文献

1.CRISPR/Cas13a-Assisted accurate and portable hepatitis D virus RNA detection.

2.Rapid and sensitive one-tube detection of mpox virus using RPA-coupled CRISPR-Cas12 assay.

3.A low-background and wash-free signal amplification F-CRISPR biosensor for sensitive quantitative and visible qualitative detection of Salmonella Typhimurium.