来自Nature综述
Abstract
细菌、古细菌、病毒和单细胞真核生物的不同微生物群落在环境和人类健康中起着至关重要的作用。然而，微生物经常难以在实验室中培养，这可能会混淆成员的命名和对群落如何运作的理解。高通量测序技术和计算流程已经应用到鸟枪法宏基因组学中，改变了微生物学。但仍然需要计算方法来克服影响基于组装和基于比对的宏基因组分析的挑战，特别是高复杂性样品或含有与测序基因组具有相似性生物的环境。了解这些群落的功能和表征特定菌株，为使用微生物工厂合成产品的治疗、发现和创新方法提供了生物技术前景，并可以确定微生物对我们的家园、动物和人类健康的贡献。
Main
高通量测序方法可以对样品中的所有微生物进行基因组分析，而不仅仅是那些适合培养的微生物。鸟枪法宏基因组学（shotgun metagenomics）是对样本中存在的所有（’meta-'）微生物基因组的非靶向（untargeted / 'shotgun’）测序。鸟枪法测序可用于分析微生物群落的分类组成和功能潜力，并恢复全基因组序列。诸如高通量16S rRNA基因测序（其描绘所选生物或单个标记基因）的方法有时被称为宏基因组学，但这是用词不当，因为它们不针对样品的整个基因组含量。
自首次使用以来的15年中，宏基因组学已经能够对复杂的微生物组进行大规模研究。通过该技术的发现，包括鉴定具有内共生行为的环境细菌门、以及可以对氨进行完全硝化的物种。其他值得注意的发现包括共生细菌中广泛存在的抗生素抗性基因，追踪人类暴发病原体，微生物组的病毒和细菌部分与炎症性肠病的强烈关联，以及监测菌株的能力 - 在粪便微生物组移植引起的扰动后肠道微生物群的变化。
在这里，我们讨论鸟枪法宏基因组学研究的最佳实践，包括目前认识和应用的局限性，并提供未来宏基因组学的展望。
在初步研究设计之后，典型的鸟枪宏基因组学研究包括五个步骤：（i）样品的收集，处理和测序; （ii）测序读长的预处理; （iii）微生物组序列分析分类学、功能和基因组特征; （iv）统计和后处理分析，以及（v）验证（图1）。许多实验和计算方法可用于执行每个步骤，这意味着研究人员面临着艰巨的选择。而且，尽管其显而易见的简单，但由于潜在的实验偏差以及计算分析及其解释的复杂性，鸟枪法宏基因组学具有局限性。我们评估每个步骤伴随的选择和常见问题。
步骤（1）：研究设计和实验方案。在宏基因组学中经常低估这一步骤的重要性。步骤（2）：数据预处理。数据质量控制（quality control，QC）步骤最小化基本序列偏差，例如去除测序接头、质量修剪、去除测序重复（使用例如FastQC，Trimmomatic或Picard工具）。过滤外源或非靶DNA序列，并且如果比较分类群或功能的多样性，则对样品进行二次采样以标准化读长数量。步骤（3）：序列分析。根据实验目标，采用“基于读长”和/或“基于组装”的方法。两种方法都有优点和局限性（表4）。步骤（4）：后处理。可以使用各种多变量统计技术来解释数据。步骤（5）：验证。高维生物学数据的结论易受研究驱动的偏差影响，因此后续验证至关重要。
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