发表杂志：Frontiers in Immunology
影响因子：5.085，即时影响因子：7.29
肿瘤微环境对乳腺癌的发生发展具有重要影响，然而，关于其中的相关分子机制仍未完全阐明。因此，本课题下载了GEO数据库中5个乳腺癌数据训练集，首先，利用ESTIMATE基质细胞评分和免疫细胞评分，CIBERSORT算法分析582个乳腺癌临床数据集中的肿瘤相关免疫细胞浸润情况，获得相关的差异基因。然后，利用单因素COX分析、LASSO回归分析和多因素COX分析差异基因，鉴定出7个特异性调节乳腺癌肿瘤免疫的基因。进一步分析了其中的一个重要基因ATP2C2，其高表达对乳腺癌患者病情进展和预后具有不良影响。采用GSEA分析，发现ATP2C2下调组富集于免疫调节相关通路，而ATP2C2上调富集于代谢相关通路。Pearoson相关性分析发现ATP2C2与滤泡样辅助T细胞成正相关，与γδ T细胞成负相关，利于维持乳腺癌TME中的抗肿瘤免疫状态。综上所述，本研究发现TAP2C2基因对乳腺癌的肿瘤免疫微环境具有潜在影响，可成为其诊疗和预后预测的可能靶点。
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研究背景：乳腺癌成全球发病第一的癌症，其高侵袭性严重威胁女性生命健康，肿瘤微环境是肿瘤赖于生存的“土壤”，其中的免疫细胞与肿瘤的发生发展密切相关。本研究中，我们基于GEO数据库，利用ESTIMATE和CIBERSORT算法等，发现了一种预测乳腺癌新的生物标志物—ATP2C2，一种与ATP酶分泌通路钙离子转运相关的分子，研究示ATP2C2与乳腺癌肿瘤微环境中信号传递相关，因此，我们基于单基因的系统生信分析，揭示ATP2C2在乳腺癌中的可能作用。
研究内容：
1 基于免疫评分和基质评分的差异基因分析
①下载乳腺癌数据训练集(GSE42568, GSE88770, GSE16446, GSE37751,GSE7390)，利用ESTIMATE进行免疫评分、基质评分。
②对免疫和基质评分中上调、下调基因分别取交集分析。
③对上述②所获基因进行GO和KEGG富集分析。
结果显示：①ImmuneScore中共获得1091个DEGs，其中692个上调基因和399个下调基因；StromalScore共获得1261个DEGs，其中上调基因852个，下调基因409个（上图A-B）；取交集共得到246个上调基因和47个下调基因（上图C-D）。
②GO分析差异基因功能主要与免疫反应有关，如白细胞增殖和白细胞迁移，KEGG富集分析也表明，DEGs参与了造血细胞谱系、Th1和Th2细胞分化以及细胞因子和细胞因子受体的相互作用（上图E-F）。
③综上表明：免疫成分在乳腺癌肿瘤微环境具有重要作用。
2 与预后相关的免疫调节基因(IRGs)筛选、建立预后预测模型
①为建立预测特征，利用单因素COX分析，获得67 IRGs后，进一步进行LASSO模型处理（下图B）。
②利用多因素COX风险回归筛选获得7个IRGs重要基因（LGMN, ATP2C2, SLCO2B1 CXCL12, LIPA, ADRB2和CELF2）。
③构建了风险评分：IRGs风险评分=（-0.212×ADRB2的表达水平）+（0.208×ATP2C2的表达水平）+（-0.287×CELF2的表达水平）+（-0.129×CXCL12的表达水平）+（0.257×LGMN的表达水平）+（-0.204×LIPA的表达水平）+（0.214×SALCO2B1的表达水平）。通过计算验证和测试集中每位患者的风险评分，使用中位数将患者分为低风险组和高风险组（下图）。
结果显示：①显示了根据风险评分分类的患者，绿色表示风险评分低于中位数的患者，红色表示风险评分高于中位数的患者（上图D-I）。
②Kaplan-Meier分析表明，在训练和验证集中，高风险组的患者预后比低风险组的患者差（上图J-K）。
③训练和验证集中的预后模型ROC曲线显示出良好的预测能力（上图L-M）。
④基于上述多因素COX风险分析结果，绘制IRGs与乳腺癌预后相关列线图，IRGs风险模型列线图具有非常好的校正（上图A-B）。
3 ATP2C2在乳腺癌中高表达，且与不良预后相关
① 乳腺癌患者中进行ATP2C2基因表达的Kaplan-Meier分析。
② TCGA数据库中分析乳腺癌组织中ATP2C2表达情况。
③ 分析ATP2C2表达与不同临床病理特征的关系。
结果显示：①乳腺癌患者中高表达ATP2C2预后生存差。
②TCGA数据库及配对分析中，ATP2C2在乳腺癌组织中较正常组织中表达增加。
③乳腺癌肿瘤微环境内高ATP2C2表达其预后差，且ATP2C2表达水平随年龄大小、肿瘤病理临床分级增高而增加。
4 ATP2C2为乳腺癌肿瘤微环境潜在预测标志物
GSEA分析乳腺癌中ATP2C2的不同表达水平对相关信号通路的影响
结果显示：
①ATP2C2低表达组主要富集于免疫调节相关通路，如细胞因子及其受体相互作用、造血细胞谱系和原发性免疫缺陷等（上图A）；A
②TP2C2高表达组主要富集于代谢途径，包括三羧酸循环、氨基糖和核苷酸糖代谢等（上图B）。
5 ATP2C2影响乳腺癌中免疫细胞浸润情况
利用CIBERSORT算法和秩和检验，分析不同ATP2C2水平下乳腺癌肿瘤微环境中22种免疫细胞浸润情况（下图A-B）。
结果显示：Treg T细胞、活化NK细胞、M1型巨噬细胞在ATP2C2高表达组明显升高，而记忆CD4+ T细胞、M0型巨噬细胞、M2型巨噬细胞等在ATP2C2低表达组明显升高。
6 ATP2C2影响肿瘤组织内T细胞（TICs）的分布相关
① 采用单因素COX分析、LASSO模型、多因素COX分析，并根据中位数构建TICs风险评分，训练和验证TICs预测模型。
② Pearson分析乳腺癌不同免疫细胞间的共表达模式（下图A），进一步分析免疫细胞和关键基因。
结果显示：T细胞与ATP2C2显著相关（上图B），且其中的Tfh细胞与ATP2C2水平成正相关，γδ T 细胞与ATP2C2成负相关（上图C-D），表明ATP2C2与肿瘤微环境中的免疫活性相关。
7 ATP2C2加剧肿瘤免疫逃逸，增加ICI治疗抗性
TIDE算法分析ATP2C2水平与细胞毒性T细胞（CTL）的关系
结果显示：低ATP2C2表达、高CTL表达的BRCA预后较好，而在高ATP2C2表达的BRCA患者中未见上述现象。
小结：在本文研究中，作者基于GEO和TCGA中乳腺癌数据，利用ESTIMATE进行免疫评分和基质评分，发现7个关键基因（LGMN, ATP2C2, SLCO2B1 CXCL12, LIPA,ADRB2和CELF2），并构建相关IRGs风险预测模型。利用CIBERSORT算法分析其中的肿瘤相关免疫细胞，构建TICs风险预测模型。研究中发现ATP2C2基因在乳腺癌中表达增加，影响其抗肿瘤免疫活性，可作为乳腺癌潜在相关生物标志物。
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