本研究旨在确定免疫相关基因在克罗恩病(CD)中的诊断和预后价值。首先，作者从基因表达综合数据库(GEO)下载了7个分析CD组织中基因表达数据。利用单样本基因集富集分析(ssGSEA)估计CD组织中免疫细胞浸润的程度。然后，作者通过将免疫相关基因与差异表达基因（DEGs）重叠筛选免疫相关DEG，并利用蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络识别关键的免疫相关DEG。随后，作者还分析了CD的诊断价值和抗TNFα治疗的预测价值。免疫组织化学(IHC)测定用于验证CD组织中的基因表达。结果表明，免疫相关基因AQP9、CD27和HVCN1可作为CD的辅助诊断指标，而AQP9可作为接受抗TNF治疗的患者的有希望的预测指标。
发表杂志：Front Immunol.
影响因子：7.562
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研究背景
克罗恩病(CD)是炎症性肠病(IBD)的主要类型，影响全球约0.5%的人口，并且在中国的发病率逐年上升。CD是一种免疫介导的疾病，其特征是胃肠道中的慢性炎症。虽然CD的确切病因在很大程度上仍然未知，但遗传和环境因素被认为是引发肠粘膜炎症过程的主要因素。迄今为止，尚无明确可以治疗CD的措施。因此，探索免疫细胞和相关细胞因子的作用对于为CD患者制定有效的治疗策略至关重要。
流程图：
分析解读：
数据收集
①从GEO数据库收集CD组织基因表达的微阵列数据集，包括GSE95095、GSE36807、GSE98820、GSE112366、GSE16879、GSE10616和GSE102133。
免疫浸润分析
①ssGSEA评分确定每个数据集样本中的免疫浸润水平。
②定义免疫细胞相关基因集，基因集的富集分数代表肿瘤浸润免疫细胞的密度。
结果：
下图：CD（n=60）中28个免疫细胞浸润热图。
下表：免疫细胞浸润水平。
免疫相关差异表达基因(DEG)的鉴定
①使用R语言的“limma包”分析CD和正常肠组织之间的差异。
②与免疫细胞特异性标记基因重叠的DEGs被定义为免疫相关的DEGs，在R语言中选择并通过维恩图进行可视化。
结果：
下图：CD组织与非炎症组织28种免疫细胞的比较。
蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析
①免疫相关DEG的PPI网络是基于STRING数据库中的数据构建的。
②Cytoscape插件“MCODE”用于识别PPI网络中每个子集的核心基因。
结果：
下图A：166个免疫相关DEG的PPI网络，每一轮节点代表一个基因。
下图B-D：PPI网络的子集，节点的绿色菱形表示子簇的关键基因。
富集分析
①使用基因本体论(GO)分析免疫相关DEG的功能。
②京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析确定基因富集的重要途径。
结果：
下图A：免疫相关DEG的GO功能分析气泡图。
下图B：免疫相关DEG的KEGG条形图。
相关性分析
①使用Pearson分析基因表达与免疫细胞分数之间的相关性。
②使用受试者工作特征曲线（ROC）分析CD患者基因表达的诊断价值和接受治疗的CD患者基因的预测值，曲线下面积（AUC）用于估计诊断或预测值。
结果：
下表：AQP9、CD27、HVCN1与CD中免疫细胞的相关性。
下图：CD中AQP9、CD27和HVCN1的诊断价值。
A：AQP9、CD27、HVCN1在CD中的诊断价值，使用非炎症组织作为对照（GSE95095数据集）
B：AQP9、CD27、HVCN1在CD中的诊断价值，使用正常肠组织作为对照（GSE95095数据集）
C：CD中AQP9、CD27、HVCN1的诊断价值（GSE36807数据集）
D：CD中AQP9、CD27、HVCN1的诊断价值（GSE102133数据集）
E：CD中AQP9、CD27、HVCN1的诊断价值（GSE16879数据集）
F：CD中AQP9、CD27、HVCN1的诊断价值（GSE10616数据集）
下图：AQP9、CD27和HVCN1在接受抗TNFα治疗的CD组织中的表达。
A：AQP9、CD27和HVCN1在GSE98820中的表达（该数据集没有CD27基因）
B：AQP9、CD27和HVCN1在GSE112366中的表达。
C：AQP9、CD27和HVCN1在GSE16879中的表达。
D：AQP9、CD27和HVCN1在GSE16879中的表达。
下图：AQP9、CD27和HVCN1在CD治疗中的预测价值。
A：AQP9和HVCN1对CD治疗的预测价值(GSE98820)
B：AQP9、CD27、HVCN1对CD治疗的预测价值(GSE16879)
C：AQP9、CD27和HVCN1在CD治疗中的预测价值(GSE112366)
实验验证
①免疫组织化学(IHC)检测。
结果：
下表：CD患者的人口统计数据。（CDAI：克罗恩病活动指数）
下图A：CD的典型内窥镜图像。
下图B：AQP9、CD27和HVCN1在邻近正常肠组织中的表达。
下图C：CD组织中AQP9、CD27和HVCN1的表达。
下图A：邻近正常肠组织和CD组织之间关于AQP9、CD27和HVCN1的IHC强度评分的比较。
下图B：CDAI评分与CD组织中AQP9、CD27和HVCN1的表达之间的相关性分析。
小结：
CD是一种慢性炎症性肠道疾病，是由针对管腔细菌抗原不可抑制的免疫反应引起的，异常的免疫系统是CD发病机制和进展的关键因素。本项研究中，作者使用ssGSEA分析CD组织中免疫细胞的比例，并应用R“limma”包筛选免疫相关差异表达基因，PPI分析和富集分析识别关键基因及途径。最后，作者通过IHC验证CD组织中AQP9、CD27和HVCN1的表达。结果表明，AQP9、CD27和HVCN1可以确定为CD的辅助诊断指标。另外，AQP9有趋向成为接受抗TNF治疗的患者的有希望的预测指标。
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