最新8+生信，肿瘤相关成纤维细胞单肿瘤分型，值得学习！

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研究背景：

三阴性乳腺癌(TNBC)是一种特殊的分子亚型，具有阴性激素受体（雌激素和孕酮受体）和人表皮生长因子受体2(HER2)的特征。内分泌治疗和常规靶向治疗对TNBC均无效。因此，探讨TNBC发生发展的机制至关重要。

肿瘤微环境(TME)作为癌细胞发育的土壤，其发挥的关键作用已在许多研究中得到证实。TME中的细胞主要包括基质细胞和免疫细胞。其中，癌症相关成纤维细胞(CAFs)是主要的基质细胞，越来越多的证据表明它们在癌症的增殖、进展和侵袭中发挥作用。

研究结果：

一、基于CAF标志物的区分在TNBC队列中发现了三个具有不同CAF浸润的群组

1、首先使用单细胞测序数据集检测经典的CAF标记物（ACTA2、FAP、PDGFRA、PDGFRB、PDPN、THY1和COL1A1）表达水平（图S1），并对来自GSE25066-TNBC、GSE21653和GSE103091队列进行分析。TCGA-TNBC、METABRIC-TNBC和GSE25066-TNBC的聚类结果如图1a、S2a和S2c所示，将患者分为不同的CAF浸润组，即低、中、高浸润组。

S1：

图1a：

S2a、c：

2、采用PCA图来验证上述队列的聚类有效性。

 图1b： 

 图S2b：

图S2d： 

3、进一步检查是否聚类结果反映了在TME中CAF的相对丰富。通过比较之前的研究中CAF的表达分数，证明低、中和高CAF浸润组的代表队列中的MCP-counter和xCell分数呈上升趋势(图2a，,2d，2g)。

4、此外，还比较了iCAF和myCAF标记物的表达情况。结果显示，高、中浸润组中大量CAF标记物表达上调(图2b、2e、2h)。

5、本研究中所有TNBC队列的CAF浸润簇见图S3a。CAF浸润组之间的总生存率没有显著性差异(图S3b-f)。

二 CAFs浸润与免疫特征的相关性

先前的研究表明CAFs在微环境的免疫调节中起着关键作用。在这里，试图研究CAFs和免疫环境之间的相关性。

1、首先，我们计算了METABRIC-TNBC、TCGA-TNBC和GSE25066-TNBC队列中不同浸润组间基因的倍数变化，并显示了免疫相关基因(图2c，2f，2i)。结果表明，在不同队列的高、中浸润组中，如CD14、TGFB3、ENTPD1、NT5E、BMP1等表达上调。其他上调的标记物在不同的队列中并不一致。

2、其次，比较了癌症中标志性信号通路的GSVA评分，高渗透组和低渗透组如图3a-c所示。结果表明：部分免疫相关信号通路在高浸润组中显著富集，如TGF-β、IL2-STAT5、TNF-α、NF-κB等信号通路。

2、由于CAFs是TGF-β的主要来源之一，基于以上结果和既往研究结果，CAFs可能通过影响肿瘤和免疫细胞来发挥其功能。我们评估了先前报道的CAF评分与CIBERSORTx免疫细胞之间的相关性(图3d-f)。结果表明，在METABRIC-TNBC队列中，MCP-counter-CAF和xCell-CAF分别与活化的NK细胞呈负相关。在TCGA-TNBC队列中，EPIC-CAF、MCP-counter-CAF和xCell-CAF均与CD8+T细胞呈负相关。在GSE25066-在TNBC队列中，xCell-CAF与CD8+T细胞呈负相关。此外，CAFs可能与M2巨噬细胞呈显著正相关，而这一结果仅在METABRIC-TNBC和GSE25066-TNBC队列中观察到。此外，xCell-CAF和EPIC-CAF分别是METABRIC-TNBC和TCGA-TNBC队列总生存的危险因素。

三，BGN表达上调，主要在基质CAFs中表达
作者试图研究CAFs衍生的有效生物标志物及其相应的预后价值。

 

1、手术切除后，从组织样本中分离出正常的癌旁成纤维细胞（NAF）和癌相关成纤维细胞（CAF）。进一步利用测序和质谱技术，探索NAF组和CAF组的转录组表达谱和差异表达基因(DEGs)(图4a)。

2、CAFs中表达的前40个DEG如图4b所示，质谱法鉴定出了前40个分泌蛋白(图4c)。与NAFs相比，CAFs中细胞外蛋白BGN表达上调。先前的研究表明，BGN在治疗耐药性和免疫活性中的作用。

3、比较了RNA测序中BGN的TPM值(图4d)。进一步比较了TCGA-TNBC队列中的BGN水平，并观察到肿瘤组织中的BGN水平显著升高(图4e)，通过Westernblot在蛋白水平上进一步验证了该结果，并观察到患者1、2和3的CAFs中大聚糖蛋白水平显著升高(图4f)。

4、为了进一步证实BGN在不同肿瘤成分中的表达谱，我们使用单细胞测序数据集分析了其表达模式。结果表明：GSE88715中显示肿瘤间质部分的BGN表达水平较高(图4g)。

5、为了进一步证实BGN在TNBC中的表达特征，分析在scRNA-seq数据集中的表达水平。BGN主要在TNBC队列的整体成纤维细胞中表达(GSE118389；图5a，5b)。在另一个具有更详细的细胞簇的数据集中，BGN主要在CAFs和血管周围样(PVL)亚群中表达(图5c-e)。

6、在这些队列中，BGN的表达水平分别与MCP-counter和xCell估计的成纤维细胞和内皮细胞的评分显著相关(图6a-c)。

这些结果进一步表明，BGN可能是TNBC中CAF特异性的生物标志物，并在细胞外基质中发挥其作用。

四，大聚糖与生物学特征和临床结果相关

BGN基因编码大聚糖，这是一种细胞外可溶性蛋白，可能通过细胞间接触发挥其功能。在这里，作者试图探讨其在肿瘤发展中的作用及其在临床实践中的预后价值。

1、首先使用BGN相关基因进行了GO富集，其结果如图6d-f所示。参与癌症发生和TME调节的代表性信号通路在METABRIC-TNBC、TCGA-TNBC、GSE25066-TNBC队列中显著富集。高BGN水平表明新血管延伸、淋巴管形成、细胞外基质重塑和促进肿瘤细胞转移。此外，BGN还与免疫抑制微环境的形成相关。这些结果表明，大聚糖可能与TNBC患者的肿瘤血管生成、TME重构和肿瘤转移有关。因此，它可能作为这些队列中的前肿瘤和免疫抑制因子。

2、因此进一步分析了BGN与免疫信号之间的关系。首先，分析BGN与免疫相关基因之间的相关性(图7a)。BGN与一些免疫抑制分子，包括TGFB1、VEGFA、VEGFB和CD276呈正相关。然而，除了GSE103091中的CTLA4和CD274(PD-L1)以及GSE21653中的BTLA外，没有观察到与经典检查点分子的显著关联。这些结果提示BGN可能影响免疫细胞浸润或调节免疫活性。

3、因此，作者计算了BGN表达与估计分数之间的相关性(图7b)。BGN与各队列的基质评分呈显著正相关。我们观察到BGN与METABRIC-TNBC、GSE21653和GSE103091的免疫评分之间存在显著相关性。

4、此外，我们检测了BGN和免疫成分之间的相关性。在METABRIC-TNBC和TCGA-TNBC队列中，BGN分别与CD8+T细胞和活化的NK细胞显著相关。此外，除METABRIC-GSE21653、GSE25066-TNBC和GSE103091外，BGN与M0巨噬细胞均相关(图7c)。

5、Kaplan-Meier分析显示，较高的BGN表达水平预示着每个队列更差的总体生存结果(图8a)。

6、最后，验证了大聚糖在SYSUCC队列中的预后价值和免疫抑制功能。患者在

高大聚糖组浸润CD8+T细胞总浸润水平较低(图8b，8c)。生存分析显示，大聚糖可能作为TNBC的一个不良预后标志物(图8d）。SYSUCC队列的单因素和多因素Cox回归模型表明，大聚糖是总生存期的独立危险因素(表S3)。

总结：

在本研究中探讨了三阴性乳腺癌中成纤维细胞的相对浸润水平，以及TME中CAFs与免疫成分之间的相关性。利用RNA测序和质谱方法发现，与正常的癌邻近成纤维细胞(NAFs)相比，在CAFs中发现了一种上调的分泌蛋白---大聚糖。大聚糖由BGN基因编码，主要在肿瘤的间质部分表达。作者发现BGN的表达水平与细胞外基质、淋巴管生成、上皮间充质转化、血管生成和TGF-β信号通路相关。单细胞测序结果显示，BGN主要在基质成纤维细胞中表达。此外，与其他细胞亚群相比，BGN在TNBC的CAFs中高表达。BGN的上调及其大聚糖在TME中发挥作用的机制可能成为一种很有前途的生物标志物，提高了靶向大聚糖可能产生临床效用的可能性。