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肿瘤分型文章比较重要的结论就是分型后构建的评分能够预测免疫治疗或者其他治疗的疗效。
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研究概述：
三级淋巴结构（TLS）正在成为某些实体瘤预后和免疫治疗的潜在预测指标，为研究TLS和膀胱癌BCa之间相互作用背后的机制，本文整合了几个独立的BCa数据集，基于39个经过验证的TLS特征基因（TSG）确定五种不同的TLS模式和四种基因簇。随后评估了所有患者的TLS模式，并将TLS模式与预后和肿瘤微环境（TME）细胞浸润特征相关联。使用cox回归模型和主成分分析（PCA）算法构建TLS评分系统，量化个体的TLS模式，发现TLS评分与免疫细胞浸润水平密切相关，可预测TLS的成熟状态，低TLS评分与更好的预后、免疫检查点阻断（ICB）免疫疗法和常用化疗药物的较好反应相关。
研究结果：
一、膀胱癌（BCa）的三级淋巴结构特征基因（TSG）景观
1.本研究共鉴定出39个基因作为TLS的基因标本，其中CCL2/3/4/5/8/18/19/21、CXCL9/10/11/13为趋化因子特征基因；CXCL13、CD200、FBLN7、ICOS、SGPP2、SH2D1A、TIGIT、PDCD1为T滤泡辅助细胞（TFH细胞）特征基因；CD4，CCR5，CXCR3，CSF2，IGSF6，IL2RA，CD38，CD40，CD5，MS4A1，SDC1，GFI1，IL1R1，IL1R2，IL10，CCL20，IRF4，TRAF6，STAT5A是T辅助细胞1细胞（TH1细胞）和B细胞特征基因；TNFRSF17是浆细胞特征基因。
2.作者首先探讨了BCa中39个TSG的体细胞突变和拷贝数变异的发生率，发现BCa的突变率很低（队列TCGA_BLCA 412个样本中的54个样本，频率为13.11%）（图1A）。
3.与IL10，GFI1，CCR5，ICOX，SGPP2，PDCD1和CCL20的较高损耗频率相比，大多数TSG具有更高的CNV增益频率（图1B）。CNV的位置如图1C所示。
4.使用R的Combat 算法来消除上述 18 个包含队列的批量效应，并将它们合并到一个新的元队列中。处理前，这些数据集可通过主成分分析（PCA）来区分（图1D），而它们在处理后合并得很好（图1E）。
5.根据每个TSG的表达水平将元队列中的样本分为两个亚组并进行生存分析发现CXCL13高表达的患者预后明显更好（图S2J）。
二、三级淋巴结构（TLS）模式和肿瘤微环境（TME）细胞浸润的特征
1.使用非负矩阵分解（NMF）算法进行聚类，当k = 5时可以看到最佳聚类效应（图2A）。元队列中的所有样本根据选择 k = 5 分为 5 种 TLS 模式，称为 TLS 簇 C1 – C5（图 2B）。
2.进行TME浸润分析，TLS簇C1在CD8 T细胞、T滤泡辅助细胞（T+FH细胞）和巨噬细胞M1显著富集；TLS簇C2在B细胞（包括幼稚B细胞、记忆B细胞和浆B细胞）、CD8 +T细胞、TFH细胞和髓系树突状细胞（DC）显著富集；TLS簇C3在调节性T细胞（T注册）富集，而其他免疫细胞的浸润水平较低；簇C4在活性肥大细胞中富集，簇C5在巨噬细胞M0，M2，成纤维细胞，内皮和中性粒细胞中富集（图2C，D）。
3.TME细胞浸润特征与生存分析结果一致，即与其他簇相比，来自簇C1和C2的患者表现出显著的生存优势（图2E）。研究五种TLS模式中的TSGs特征（图2F），五个集群中25种TSG转录谱出现显著差异。簇C1的特点是CXCL9、CXCL10和CXCL13的表达水平显著升高；簇C2在CXCL13、ICOS、SH2D1A、CD4、CXCR3、CD38、CD5和MS4A1中显著富集；簇C3富集SDC1，而其他TGS表达显著降低；簇C4在CCL20中显著富集；簇C5在CXCL2、CXCL8和CXCL18中的表达量增加，在SDC1和CCL20中表达量降低。
三、差异表达基因（DEG）的生成和共识聚类
1.为探索五种TLS模式中不同特征背后的潜在机制，作者使用R包“limma”发现77个TLS集群相关的DEG（图3A）。
2.采用Cox回归模型筛选出33例具有预后价值的DEG。首先通过R包clusterProfiler进行GO和KEGG富集分析，发现生物过程（BP）的富集，即细胞间粘附、免疫细胞活化和粒细胞趋化性；细胞成分（CC），质膜，内吞囊泡；分子功能（MF），即细胞因子受体结合、细胞因子和趋化因子活性（图3B）。KEGG分析结果类似，其细胞因子 - 细胞因子受体反应和T细胞信号通路表现出高度富集（图3C）。
3.利用这33个TLS相关聚类DEG进行无监督聚类算法的聚类分析，选择k = 4作为最佳k值，最终将患者分为四个基因簇，命名为基因簇A – D（图3D）。使用累积分布函数（CDF）曲线验证分组的合理性（图S3I，J），并在轨迹图上给出了分组的细节（图S3K）。
4.研究四个基因簇之间TME细胞浸润的差异（图3E，F）发现与TLS模式相似的浸润特征，基因簇A显示CD8 +T细胞，B谱系，TFH，自然杀伤细胞（NK细胞）和巨噬细胞M1的浸润水平显著较高；基因簇B显示CD8+ T细胞、NK细胞、巨噬细胞M1和中性粒细胞浸润水平较高；基因簇C富含T+而其他免疫细胞表现出低水平;基因簇D在成纤维细胞，内皮细胞中富集，在巨噬细胞M2和B谱系中表现出较高水平。
5. 生存分析显示，基因簇A患者比簇B-D患者预后最佳（图3G）。
这五个基因簇中TSG的表达水平（图3H）：基因簇A除SDC1外，大多数TSG的表达水平均显著较高；簇B表现出较高的CCL8、CCL18、CXCL10、CXCL13、ICOS、SH2D1A、CSF2、CD38和CCL20的表达；簇C仅表现出较高的SDC1表达，并且大多数TSG的水平显着降低;簇D的CCL2、CD200、IL1R1和IL10表达水平较高。
四、构建TLS评分
1.上述分析阐明了基于患者群体的BCa中TLS特征的格局。然而由于患者之间的异质性，TLS模式和基因簇可能无法揭示特定个体的真实情况。因此作者构建了一个评分系统来量化个体的TLS模式。将评分系统命名为TLS评分，根据该评分将患者分为TLS评分高组和TLS评分低组。
2.利用基因集富集分析（GSEA）研究高低组之间的差异活性途径，低TLS评分组的免疫应答、细胞因子和抗原抗体反应途径显著富集，如适应性免疫应答、免疫应答信号通路、淋巴细胞介导的免疫、免疫球蛋白复合物、同种异体移植通路、炎症反应、抗原加工、细胞因子-受体相互作用（图4A-C)；而高TLS评分组显示代谢相关途径和细胞生长和分化相关途径富集，例如类固醇激素合成，视黄醇代谢，药物代谢细胞色素P450和表皮细胞分化（图4D-F）。
3.分别对元队列和18个队列进行了生存分析。在元队列和IMvigor210免疫治疗队列中观察到TLS评分低的患者具有显著的生存优势（图4G，H）。
4.分析TLS评分与TMB之间的关系，没有发现它们之间存在显著相关性（图4I）。故作者将TLS评分和TMB结合起来预测预后（图4J）。TMB高和TLS低评分的患者总生存期最高，TMB低和TLS高的患者总生存期最差。TMB高和TLS低评分的患者比TMB高和TLS高评分的患者生存率更高。分析表明，TLS评分是独立于TMB的BCa患者预后的绝佳预测指标，同时比TMB效果更好。
五、TLS 评分和 TME 细胞浸润
1.考虑到TLS在抗肿瘤免疫中的关键作用，采用9种算法全面研究了两个TLS评分组TME细胞浸润的特征。Sankey图显示个体患者的可视化属性变化（图5A）。如图5B所示，低TLS评分组的免疫评分和ESTIMATE评分较高。
2.ssGSEA显示了两组免疫功能的差异，低分组在除IFN-β反应外的几乎所有抗肿瘤过程中都具有更好的免疫功能（图5C）。
3.采用TIMER，CIBERSORT，CIBERSORT-ABS，QUANTISEQ，MCPCOUNTER，XCELL和EPIC方法对TME细胞进行成分分析（图5D）。与高分组相比，低分组B细胞、T细胞（CD4 T细胞和CD8 T细胞）、巨噬细胞（巨噬细胞M1和巨噬细胞M2）、髓系树突状细胞和NK细胞的浸润水平显著较高，TLS评分越低，免疫细胞浸润越高。
4.图5E显示TLS评分与免疫细胞浸润水平之间的相关性。TLS评分值与B细胞（图6A，B）呈显著负相关，包括幼稚B细胞，记忆B细胞和浆细胞；T细胞包括各种类型的CD4 T细胞，CD8 +T细胞和TFH细胞（图6C-E）;巨噬细胞包括巨噬细胞M1和巨噬细胞M2（图6F）。
5.此外，TLS评分与髓系树突状细胞和NK细胞呈显著负相关（图6G，H）。TLS评分与内皮细胞呈正相关（图6I）。一般来说，TLS评分与大多数免疫细胞的浸润水平呈显著负相关。
六、TLS在免疫治疗和化疗中的特点
1.上述结果表明，TLS评分是预后的绝佳预测指标，并且与免疫细胞的浸润水平密切相关。基于此，作者认为低TLS评分可能表明免疫亚型对免疫治疗更敏感。因此研究TLS评分与ICB治疗反应之间的相关性，发现低TLS评分与对抗PD-1免疫治疗的更好反应显著相关，并且在Bonferroni校正后仍然存在显着相关性（图7A）。
2.根据患者使用抗PD-L1和抗CTLA-4治疗的情况将患者分为四个亚组：CTLA-4阳性PD-1阳性（图7B），CTLA-4阳性PD-1阴性（图7C），CTLA-4阴性PD-1阳性（图7D），CTLA-4阴性PD-1阴性（图7E）。
3.在所有四个亚组中，低TLS评分组的IPS评分明显高于低TLS评分组，这表明与高TLS评分相比，低TLS评分组的患者对抗PD-1、抗CTLA-4或联合免疫治疗的反应更好。作者还进行了肿瘤免疫功能障碍和排除（TIDE）分析，TLS评分与高TIDE评分相关。这种免疫逃避效应可能是由于低TLS评分组Treg浸润水平较高所致(图4C)。
4.研究TLS评分与化疗反应之间的关系：应用R包oncoPredict并检查了几种常用药物，如用于术后辅助治疗的吉西他滨、顺铂和长春花碱，以及用于膀胱内滴注的表柔比星。低TLS评分与吉西他滨、顺铂、长春花碱和表柔比星的敏感性评分较低显著相关（图7F-I），这表明低TLS评分组与化疗敏感性较高相关。
研究总结：
本文证明了TLS在BCa中的特征，通过使用TLS评分系统可以评估个体的TLS模式。并预测BCa的TME细胞浸润、TLS成熟、预后、对免疫治疗和化疗的反应。该系统有助于指导BCa的临床策略和精准医学。
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