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研究背景：
代谢改变是癌细胞的重要标志，而三磷酸核苷酸的合成和使用是不同癌症类型和遗传背景的癌细胞的重要和普遍的代谢依赖。癌细胞的许多侵袭性行为，包括失控的增殖、化疗耐药、免疫逃避和转移，在很大程度上依赖于增强的核苷酸代谢。此外，大多数已知的致癌驱动基因上调核苷酸的生物合成能力，这表明这一表型是癌症发生和发展的先决条件。尽管有大量数据证明了核苷酸合成抑制剂在临床前癌症模型中的疗效，并且这些药物在某些癌症环境中的临床应用已经成熟，但这些药物的全部潜力仍未实现。
针对核苷酸代谢酶重点是联合治疗策略的新兴途径(表1)
研究结果：
一、核苷酸代谢概述
1、简要解释了嘧啶和嘌呤核苷酸的生物合成途径，讨论了核苷酸水平在细胞分裂过程中的调节，并突出了常见的核苷酸代谢异常的致癌例子。
2、嘧啶和嘌呤的合成：嘧啶和嘌呤的从头和挽救途径通过不同的条件发生（图1）。嘧啶从头合成途径首先生成芳香族碱基(乳清酸)，然后在磷酸核糖焦磷酸(PRPP)依赖的反应中添加核糖5-磷酸部分，而嘌呤从头合成途径从PRPP开始，逐步将芳香族碱基构建到核糖骨架上。嘌呤脱氧核苷、脱氧腺苷和脱氧鸟苷可被DCK磷酸化，分别形成dAMP和dGMP，这组反应被认为是嘌呤核苷-核碱基挽救途径。
3、核苷酸水平的生理控制：
为了进行细胞分裂，静息细胞必须显著增加其dNTP和NTP池，分别增加5 -10倍和至少10倍。尽管从头合成核苷酸在碳和能量方面远比回收核苷昂贵，但需要迅速扩大核苷酸库来满足这些需求。增殖细胞中NTP的浓度在100µM到几个μ mol之间，而dNTP的浓度通常在10-100µM之间，在特定的细胞类型中，dNTP的相对浓度通常是平衡的。细胞增殖的许多典型驱动因子，如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号传导，可增加关键从头途径酶的表达和活性，包括氨甲酰磷酸合成酶2 (CPSII)、天冬氨酸氨甲酰转移酶(ATC)和二氢乳糜蛋白酶(DHOase)复合物(CAD)。为了确保各种(d)NTP相对丰度的平衡，关键从头途径酶(如RNR和CAD复合物成分)在负反馈回路中被其(d)NTP终产物变构下调。此外，由核苷酸磷酸化酶启动的核苷酸分解代谢平衡核苷酸合成。这种复杂的相互作用使细胞能够动态地调整它们的核苷酸池，以满足细胞分裂的需要。
4、核苷酸合成的致癌活化：
虽然(d)NTPs的精确细胞内浓度因细胞类型、细胞环境和培养条件而有很大差异，但一篇对600多个已发表数值的综述估计，癌细胞的dNTP平均水平是非恶性增殖细胞的6 - 11倍，NTP浓度是非恶性增殖细胞的1.25 - 5倍。许多众所周知的癌基因已被证明会加强(d)NTP合成的过度活跃;例如，突变体KRAS8,25, PI3K26和MYC都是人类癌症的常见驱动因子，它们促进关键从头途径酶的活性和表达，并通过增加细胞对葡萄糖和其他营养物质的摄取来提供所需的ATP、核糖和氨基酸，从而间接支持从头途径通量。相反，据报道，核苷酸分解代谢酶(例如将dNTP转化为脱氧核苷的SAM结构域和HD结构域包含蛋白1 [SAMDH1])的功能缺失突变或沉默可通过阻止核苷酸降解而增加核苷酸库。鉴于核苷酸水平在人类癌症中普遍上调，以及核苷酸水平在各种恶性细胞行为中发挥的关键作用，以及新生途径活性对大多数哺乳动物组织的内环境稳态无关，因此新生途径酶是癌症治疗的合理靶点。
二、靶向核苷酸合成
1、核苷酸合成酶已被证明是高度易处理的药物靶点。简要讨论突出的临床可用药酶，其抑制剂和其作用机制。表2提供了临床相关核苷酸合成抑制剂的代表性描述。
2、DHFR抑制剂：Farber和Diamond在20世纪40年代描述了抗叶酸化合物对儿童白血病的疗效，此后，靶向叶酸代谢和下游胸腺嘧啶合成的药物已成为许多癌症治疗的支柱。甲氨蝶呤(MTX)是DHFR的竞争性抑制剂，常用于治疗各种癌症和自身免疫性疾病。DHFR抑制导致叶酸循环中间体耗竭，这些中间体分别是从头合成胸腺嘧啶和嘌呤的甲基和甲酰供体。
3、TS的抑制剂：TS抑制剂如5-氟尿嘧啶(5-FU)和叶酸类似物培美曲塞的抗癌效果说明了dTTP的重要性。
4、DHODH抑制剂：DHODH是由天门冬氨酸合成一磷酸尿苷(UMP)途径中的关键酶，它的抑制会导致所有的嘧啶(d)NTPs枯竭，因为它们都来自UMP(图1a)。
5、IMPDH抑制剂：单磷酸肌苷(IMP)是嘌呤从头途径中的一种中间体，可以转化为AMP或GMP(图1b)。该途径的两步GMP生产臂是几种已批准的药物的靶点。霉酚酸(MPA)是IMPDH1和IMPDH2的非竞争性抑制剂，可在GMP合成前将IMP转化为XMP。
6、RNR抑制剂：RNR是所有dntp从头合成所必需的，因为它会降低ndp的核糖部分的2 '碳以生成dNDP。羟基脲是一种批准的RNR抑制剂，用于治疗镰状细胞性贫血、骨髓增生性疾病和其他疾病。
三、抑制(d)NTP合成对生长和增殖的影响
1、核苷酸和脱氧核苷酸是许多对细胞生长和增殖至关重要的合成代谢过程的必需底物。因此，(d)NTP使用从头途径抑制剂去除NTP会损害几个促进肿瘤生长的过程，包括DNA复制/修复、核糖体生物发生和蛋白质翻译、致癌mRNA转录、翻译后蛋白质糖基化和维持稳态细胞氧化还原平衡。
2、(d)NTP合成抑制对DNA复制和修复的影响：在DNA复制过程中，四种dNTP的相对丰度受到RNR和SAMDH1的严格控制，dNTP池的失衡会导致碱基的错误掺和，导致突变或DNA损伤。5-FU、培美曲塞或MTX对TS的抑制导致脱氧尿苷三磷酸(dUTP)比dTTP大量过剩(图2a)。
3、(d)NTP合成抑制核糖体生物发生和蛋白质翻译的影响：虽然核糖体RNA (rRNA)占所有细胞RNA质量的绝大多数，但在癌细胞中经常观察到rRNA质量增加和核仁肥大，从而促进了蛋白翻译的过度活跃。dNTP是DNA合成所必需的，而NTPs是RNA转录所必需的，使用阻断dNTP和NTP形成的抑制剂(如dhdh或IMPDH抑制剂)清除它们预计将限制rRNA转录和翻译能力(图2b)。
4、(d)抑制NTP合成对mRNA转录和控制癌细胞分化的影响：核苷酸饥饿显著影响癌细胞的转录组谱。在一项使用斑马鱼黑色素瘤起始模进行的优雅研究中，White等发现，DHODH抑制产生的效应与Spt5基因缺失产生的效应相似，Spt5是RNA聚合酶ⅱ(Polⅱ)相关因子，对于Polⅱ从启动子近端暂停状态转变为高效延长至关重要68(图2b)。
5、(d)NTP合成抑制对翻译后蛋白糖基化的影响：三磷酸尿苷或三磷酸胞苷(CTP)是激活糖部分进行糖基化反应所必需的。因此，嘧啶NTPs的消耗可能会损害糖基化反应。虽然嘧啶耗竭对蛋白质(和脂质)糖基化下游的整体影响仍有待确定，但这种关系已在o -连接n -乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)的糖基化中得到验证(图2c)。
6、核苷酸代谢改变调节ROS稳态：癌症细胞必须通过将活性氧(ROS)水平维持在狭窄范围内来管理氧化应激。癌细胞ROS稳态的破坏可发生于许多不同代谢扰动(如高血糖)或遗传毒性扰动(如吉西他滨)的下游，或者通过微环境的改变(如酸中毒)，通常是通过细胞抗氧化剂NADPH和还原型谷胱甘肽(GSH)的耗竭。有趣的是，嘧啶核苷尿苷和脱氧尿苷已成为氧化应激的强效缓解剂。事实上，最近的研究表明，在毒胡萝卜素或吉西他滨处理的胰腺导管腺癌(PDAC)细胞中，胞苷脱氨酶(CDA)产生的脱氧尿嘧啶核苷可减少ROS积累，并减轻内质网(ER)应激。抑制CDA(通过四氢尿苷)或DHODH(通过来氟米特)消耗细胞内脱氧尿嘧啶核苷，加重毒胡萝卜素介导的细胞死亡，而补充脱氧尿嘧啶核苷通过减轻氧化和内质网应激挽救细胞免受毒胡萝卜素毒性(图2d)。
四、改变的核苷酸代谢驱动癌细胞免疫逃避
1、越来越多的临床前证据表明，紊乱的癌细胞代谢通过改变肿瘤微环境(TME)的代谢景观促进免疫逃避。
2、嘌呤能信号在免疫和自身免疫中的作用：嘌呤核苷腺苷是一种抗癌免疫抑制剂。通过细胞表面腺苷受体进行的腺苷信号传导抑制了TME中T细胞、巨噬细胞、固有免疫细胞和树突状细胞的抗癌活性(图3a)。
3、有报道最近阐明了FAMIN抑制抗原特异性免疫和预防流感感染后有害自身炎症的复杂机制。树突状细胞中FAMIN的基因失活增强了它们的摄取、MHCⅱ类分子介导的抗原呈递和MHCⅰ类分子介导的抗原交叉呈递，导致T细胞的扩增启动。在机制上，树突状细胞中的FAMIN失活有两个主要影响:首先，它增加了通过IMPDH1和IMPDH2的通量(可能是通过阻止FAMIN介导的PNP活性来限制嘌呤核碱基挽救)，从而增加细胞质NADH - NAD +比值;这反过来又引起细胞质酸化，导致囊泡运输加速。其次，它减少了肌苷的合成和分泌，而肌苷通常通过类似于腺苷的方式通过T细胞腺苷A2A受体发出信号，从而在树突状细胞启动期间抑制T细胞活化(图3b)。
4、(d)NTP合成抑制对TLRs核苷激活的影响：核糖核苷鸟苷和尿苷分别通过结合toll样受体7 (TLR7)和TLR8促进促炎信号。虽然核苷酸合成抑制剂对TLR7和TLR8信号传导的影响尚不明确，但尿苷或鸟苷的消耗可能会抑制TLR7和TLR8的活性，并抑制树突状细胞或单核细胞的促炎反应。这一机制可能是DHDH抑制剂或IMPDH1/2抑制剂具有免疫调节活性的部分原因，它们可能分别消耗溶酶体尿苷或鸟苷。
5、TS和IMPDH1/2抑制剂改善免疫检查点阻断治疗的反应：一些应用最广泛的抗癌药物针对TS，包括5-FU、培美曲塞和甲氨蝶呤。2018年，培美曲塞、卡铂和抗pd1抗体帕博利珠单抗(pembrolizumab)成为首个获得FDA批准的化疗联合免疫治疗方案，其依据是晚期非小细胞肺癌患者的无进展生存期和总缓解率高于单独化。在动物模型中，培美曲塞通过诱导肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡、促进有利免疫亚群(如活化的CD8+ T细胞)浸润到肿瘤中以及增加T细胞执行OXPHOS的能力，从而增强其效应功能，从而增强抗癌免疫和抗PDL1抗体疗效。
6、核苷酸合成抑制剂对自身免疫和癌症的双重作用：核苷酸合成抑制剂联合免疫检查点阻断的疗效似乎是矛盾的，因为这些药物也通常用于治疗自身免疫综合征。
五、转移中的核苷酸代谢
1、转移是大多数实体瘤患者癌症相关死亡的关键原因。转移性定植是一个多步骤的过程，需要癌细胞从原发肿瘤部位逃逸，在体循环的恶劣条件下存活并随后建立远端器官的新生境。
2、GTP激活转移前GTPase:单体GTP酶蛋白(最显著的是RHO GTP酶家族成员)在癌细胞转移所需的几个过程中发挥关键作用，包括迁移、侵袭和细胞外基质降解125。这些蛋白质只在GTP结合的“on”状态下有活性，因此人们可能会认为它们的激活依赖于足够的GTP池来驱动鸟嘌呤核苷酸交换因子。
3、通过过表达GMP还原酶(GMPR)或通过抑制IMPDH来减少GTP池在体外损害黑色素瘤的迁移和侵袭，并通过阻止RHO GTP酶家族成员RHO, RAC和CDC42的活化来损害肿瘤异种移植模型中的转移(图4)。
4、DHODH是转移的驱动因素：最近，在小鼠结直肠癌模型中，抑制嘧啶从头途径被证明可以消除肝转。在以往的研究中，从结直肠癌患者制备了患者来源的异种移植物(PDX)，并比较了有效转移至小鼠肝脏的PDX组织与未有效转移至小鼠肝脏的PDX组织的代谢特征。
六、核苷酸代谢与治疗耐药性
1、癌症治疗抵抗，定义为医疗干预未能根除肿瘤或控制肿瘤生长，可以被视为大多数癌症死亡的原因。核苷酸代谢与多种癌症疗法的耐药性相关，包括遗传毒性化疗、放疗和靶向药物(以及上文讨论的免疫治疗)。
2、内源性核苷酸与核苷类似物化疗药物的分子竞争：吉西他滨或2 '，2 ' -二氟脱氧胞苷是一种脱氧核苷类似物前体药物，必须通过嘧啶核苷补救途径才能被激活。吉西他滨被核苷转运体摄取后，被DCK磷酸化形成吉西他滨一磷酸，然后进一步磷酸化形成吉西他滨二磷酸和吉西他滨三磷酸，分别通过抑制RNR或并入DNA引起链终止来发挥其毒。吉西他滨代谢物与其内源性脱氧胞苷酸对应物竞争(图5a)，吉西他滨的毒性与靶细胞中吉西他滨衍生的代谢物与内源性dNTP的比率相关。PDAC细胞对吉西他滨的获得性耐药是由黏蛋白1 (MUC1)和缺氧诱导因子1α (HIF1α)下游的脱氧CTP (dCTP)池增加引起，这些脱氧CTP (dCTP)池通过非氧化磷酸戊糖途径输送葡萄糖，从而提供PRPP用于从头合成嘧啶，并增强CTP合成酶活性，从而增加dCTP池(图5a)。
3、嘧啶dNTP损耗损害基因毒性化疗的DNA修复：DHODH抑制可提高癌细胞对遗传毒性药物的敏感性，即使这些药物不是与(d)NTPs有直接分子竞争的核苷类似物。例如，在体外，三阴性乳腺癌细胞对多柔比星或顺铂产生应答，通过嘧啶从头途径上调通量，导致dCTP和dTTP池增加，从而促进遗传毒性应激下的DNA修复。
4、(d)NTP促进对放射治疗的抵抗：放射治疗是许多癌症的有效治疗方法，但对于一些侵袭性癌症，如GBM，治疗后复发和随后的疾病进展常见。大量GBM细胞系的代谢谱分析表明，嘌呤核苷酸丰度，尤其是(d)GTP丰度与放射治疗的耐药性密切相关。
5、从概念上讲，核苷酸耗竭联合遗传毒性化疗或放疗不同于联合多种遗传毒性药物或联合多种遗传毒性药物+放疗，因为核苷酸耗竭会使细胞丧失DNA修复所需的dNTP(图5b)。
6、(d)NTP合成抑制剂与致癌信号激酶抑制剂协同作用：通过嘧啶从头途径的通量在各种致癌信号通路的下游增。在PI3K或MAPK通路激活的下游，CAD活性分别通过S6K (Ser1869或ERK (Thr456)的磷酸化来加速。因此，PTEN缺失或EGFR扩增的GBM肿瘤分别显示CADS1869或CADT456磷酸化增加。
7、(d)NTP合成抑制剂与细胞死亡诱导因子协同作用：DHODH通过还原泛素醇(一种专性DHODH反应产物)的形式向线粒体内膜提供还原力，因此限制了线粒体内膜中脂质的过氧化作用(铁死亡的关键步骤。据报道，dHDH抑制剂可降低线粒体膜电位，而维持线粒体膜电位在对抗细胞凋亡中起关键作用142。因此，DHODH抑制剂有可能与维奈托克(venetoclax)等诱导凋亡药物和其他BCL-2拮抗剂合作(图5c)。
七、对核苷酸合成抑制剂的耐药性
1、有三种可能的机制可以解释癌细胞对核苷酸合成抑制剂的耐药性。首先，尽管NTP严重短缺，癌细胞仍可能进行致癌生长。第二，尽管抑制了关键的从头途径酶，癌细胞仍可能获得足够的(d)NTPs，从而使疾病进展。最后，体内核苷酸消耗的程度和时间可能不足以导致癌细胞的核苷酸饥饿，原因可能是与靶点的结合不足或给药方案欠佳。
2、核苷挽救和耐药：由于核苷补救途径可独立于从头合成途径提供核苷酸，因此预期补救途径可导致对从头合成途径抑制剂的耐药。
3、核苷摄取阻断剂可以克服对从头途径抑制剂的耐药性：许多研究报道了brequinar与平衡核苷转运蛋白1 (ENT1)和ENT2抑制剂双嘧达莫(dipyridamole)之间的体外协同作用，被认为是核苷内流的主要介。然而，这一联合策略的临床前体内表现好坏参半，与brequinar单药治疗相比，最多有小幅改善，但这可能受到brequinar单药治疗在这些模型系统中令人印象深刻的疗效的影响
4、靶向核苷打捞酶可以克服novo途径抑制剂的耐药性：核苷挽救途径酶与DHODH抑制剂耐药有关。与DCTD表达相对较高的PDAC和肺腺癌基因工程小鼠模型相比，小细胞肺癌基因工程小鼠模型对brequinar的敏感性。DCTD产生dUMP，否则会对dHDH抑制产生限制;因此，DCTD敲除增强了来自PDAC细胞系和肺腺癌小鼠模型的brequinar敏感性。
5、通过自噬介导的RNA降解的核苷酸循环：除新生和挽救途径外，细胞还可以通过自噬(特别是自噬体中细胞核酸的降解)获得核苷酸。此过程产生(d)NMPs，且不依赖细胞外核苷的摄取，也不依赖核苷补救酶对核苷或核碱基的磷酸化或磷酸核糖基化。最近的研究发现，去除嘌呤或嘧啶NTPs可诱导HEK-293T细胞的自噬。嘌呤缺失通过拮抗mTOR激活激活自噬，而嘧啶缺失通过明显不依赖mTOR的机制实现这一作用。这些结果表明，NTP丰度在调节自噬方面具有不同的作用，需要进一步研究这些机制是否在癌症中起作用。
八、评估核苷酸合成抑制剂
1、代谢酶抑制剂与含铂类药物、环磷酰胺、替莫唑胺和白消安等烷化化疗有本质区别。对于烷化剂，随时间推移的累积药物暴露量(曲线下面积)与抗癌疗效和患者毒性成正比，这反映出这些药物共价结合DNA和其他分子，因此通过发挥其毒性而消耗物理能量。
2、目标参与监测：对于靶酶抑制，纵向定量血浆生物标志物(例如监测二氢乳清酸盐或dhdh抑制剂的其他上游代谢物)是确保体内持续药效学靶点结合的一种有用的无创方法。如果可能，对这些生物标志物治疗前和治疗中水平的直接比较将有力地证实靶酶抑制。
总结：紊乱的核苷酸代谢对各种癌症类型的几乎所有恶性细胞活动都有重要影响，因此代表了泛癌症的代谢依赖性。除了作为核酸生物发生的底物的典型作用，核苷酸还为癌症细胞中过度活跃的一系列过程提供燃料。因此，核苷酸合成抑制剂作为联合治疗策略的元素具有巨大的潜力，但尚未完全实现。本综述汇总了近期临床前进展中出现的一组联合治疗概念，这些概念具有说明性，但绝不是全面的(有待进一步验证)。核苷酸合成抑制剂正在进行和未来的临床研究将受益于基于这些药物的严格药代动力学和药效学特征的剂量方案标准化。药物开发活动将可能产生针对现有临床药物靶点的更强效和选择性的抑制剂，如dhdh、TS、RNR、CD73和ENT1/2，并可能将其他关键酶，如DCK、UCK和CDA纳入临床药理学控制。这些进展的医学影响将波及肿瘤学以外的领域，并将为感染、自身免疫性疾病、神经变性综合征和其他疾病的治疗开辟新的途径。
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