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影响因子：7.3

研究概述：作为血管炎的主要亚群，抗中性粒细胞胞浆抗体相关血管炎（AAV）是一种相对罕见的自身免疫性疾病，影响肾脏功能。由AAV引起的肾小球肾炎称为ANCA相关性肾小球肾炎(ANCA-GN)。NETs（中性粒细胞胞外核外陷阱）NET可能参与AAV的发生和发展。当AAV中的核染色体作为NETs从细胞的外层空间挤出时，它可以诱发一种新型的细胞死亡，称为NETosis。本研究中，加权基因共表达网络分析（WGCNA）用于识别与ANCA-GN中临床性状相关的模块，与NETs相关基因相交，并识别差异表达的NETs（DE-NETs）。DE-NET用于构建NETosisScore模型，该模型用于将样本分为高风险组和低风险组。探索了这些群体的基因表达、免疫微环境和生物功能。通过三种机器学习方法筛选了NETosis相关基因（NRG），并探索了其潜在的生物功能、免疫细胞入侵和临床价值。QPCR在ANCA-GN患者的全血样本中验证了大多数NRG的差异表达，为干预提供了新的见解。

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研究结果：

流程图

一、WGCNA构建和hub模块识别

作者将两个数据集GSE108109和GSE104948合并为一个队列进行进一步分析，选择了β = 9（无尺度R2 = 0.9）的软阈值（图2A），密切相关的模块使用0.25的聚类高度阈值进行合并，并显示在聚类树下方（图2B），确定了与ANCA-GN相关的三个模块（图2C）。这三个模块中的基因与已知的NETs基因集相交，黄色模块与NETs的交集最多（图2E），发现黄色模块和ANCA-GN组之间存在显著的正相关性。此外，根据黄色模块中的散点图，GS和MM之间也发现了显著的相关性（图2D）。因此，黄色模块被确定为与ANCA-GN的NETosis最相关的模块。从图2F可以看出，ANCA-GN和对照组之间的差异，最后，18个DE-NET被纳入了研究。

二、DE-NET的功能分析

GO富集分析中，“白细胞介素-6生产的积极调节”、“细胞因子生产的积极调节”和“白细胞介素-8生产的积极调节”主要富集在生物过程（BP）中，白细胞介素-8主要富集在生物过程中（BP），“分泌颗粒膜”、“三级颗粒”和“富集ficolin−1−的颗粒”主要富集于细胞组成中（CC），而“水解酶活性主要富集在分子功能（MF）中（图3A）。在KEGG富集分析中，“中性粒细胞胞外陷阱形成”、“toll样受体信号通路”和“金黄色葡萄球菌感染”主要富集（图3B），这表明炎症因子产生和toll样受体信号通路可能参与ANCA-GN中NETosis的形成。

三、NETosisScore模型的构建和验证

基于18DE-NET的ssGSEA得分中位数构建了NETosis评分（NETosisScore），64名患者被分为高风险和低风险组（图4A）。通过主成分分析（PCA）可以清楚地区分高风险和低风险群体之间的分布（图4B）。从两组的NETosisScore分布图中可以看出，随着评分的增加，高风险组的患者数量逐渐增加（图4C）。所有DE-NET在高风险组和低风险组之间都有显著的差异表达（图4D）。NETosisScore可以显著区分正常对照组和ANCA-GN患者（p=2.3e-10），与正常对照组相比，ANCA-GN患者的NETosisScore更高（图4E）；训练集中NETosisScore的ROC曲线下的面积为0.920（p<0.001）（图4H）。在E-MTAB-1994集（p=0.003）和GSE104954集（p=0.00017）（图4G）中，ANCA-GN组的NETosisScore不仅在统计学上明显高于对照组，而且在E-MTAB-1994集（p<0.001）中发现ROC曲线的面积为0.797（图4I）和GSE104954集（图4J）为0.825。

四、两种NETosisScore亚型的免疫学特征和生物途径

作者比较了高风险组和低风险组之间的免疫细胞浸润丰度，与低风险组相比，高风险组的免疫细胞浸润量更高。激活的CD4 T细胞、中央CD4记忆T细胞和效应CD4记忆T细胞在两个亚组中都有显著的差异表达，高危组的水平较高（图5A），NETosisScore与几个CD4 T细胞呈正相关（图5B）。Treg细胞在高危NETosisScore组中表现出最显著的相关性和最高的相关系数（图5C）。

在高风险组中，主要是细胞对生物刺激、白细胞介素-6产生、白细胞迁移和吞噬作用的反应（图5D），而在低风险组中，主要是α氨基酸代谢、单羧酸分解代谢和有机酸分解代谢（图5E）。B细胞受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号通路和NOD样受体信号通路在高风险组中富集，而其他途径，如赖氨酸降解、组氨酸代谢和脂肪酸代谢，在低风险组中更集中（图5F）。

五、NETosis相关基因的鉴定

作者使用SVM-RFE算法根据18个DE-NET筛选出8个基因（图6A，B）。接下来应用随机森林树算法来识别七个基因（图6C，D），Lasso回归确定了10个NRG（图6E，F）。随后，三种机器学习算法的结果取交集，最后六个重要基因被确定为ANCA-GN潜在生物标志物的NRG（CYBB、ITGB2、ITGAM、TLR2、TLR7和LILRB2）（图6G）。

六、NRGs的免疫特性和相互作用功能分析

使用28种免疫细胞浸润或免疫反应来探索ANCA-GN组和对照组之间的免疫特征差异（图7A），ANCA-GN组的CCR、巨噬细胞、T细胞抑制和TIL水平明显高于健康对照组（图7B）。

通过GO/KEGG富集对26个相关基因分析，富集的生物过程（BP）包括调节白细胞介素-8的产生和调节白细胞细胞介素-6的产生，以及细胞对生物刺激的反应。最富集的细胞成分（CC）是分泌颗粒膜、质膜组成部分和三级颗粒。分子功能（MF）类别富含肽结合、DNA结合转录因子活性的正调控以及以氧为受体作用于NAD（P）H的氧化还原酶活性（图7D）。KEGG分析显示，toll样受体信号通路、模式识别受体信号通路和NIK/NFκB信号通路主要富集（图7E）。

七、线谱图的构建和临床肾功能分析

基于训练集（GSE104948和GSE108109）中6个NRG（CYBB、ITGB2、ITGAM、TLR2、TLR7和LILRB2）的表达水平构建了ANCA-GN的临床诊断模型（图8A）。校准曲线显示了ANCA-GN的实际风险和预测风险之间的最小差异（图8B）。DCA表明，当DCA曲线的高风险阈值为0-1时，该模型明显高于其他单个NRG（图8C）。ROC曲线显示，模型曲线（AUC）下的面积约为0.984，高于任何其他单个基因的AUC（图8D）。校准曲线、DCA曲线分析和模型ROC曲线的AUC结果与训练数据集一致（图8E-G）。

Spearman相关分析显示，随着肾功能的下降，6个NRG的表达水平增加，所有NRG都与GFR呈正相关。TLR2和GFR之间发现了最强的相关性（图8H）。所有6个NRG都与Scr水平呈负相关（图8I）。

八、NRG的独立数据集验证

进行独立数据集验证，在GSE104954（p<0.001）（图9A）和E-MTAB-1944（p<0.001）（图9B）中检测到了六个NRG的差异表达。在训练数据集中，所有NRG都表现出高水平的诊断准确性，如ROC曲线（AUC）下的区域所示，这些区域都大于0.90（图9C-H）。

九、qPCR和免疫组织化学染色

qPCR结果表明，除ITGB2外，与健康对照组相比，ANCA-GN患者的所有NRG都明显过度表达，ANCA-GN组和健康组之间的表达水平在统计学上显著（图10A-F）。

对ANCA-GN患者和肾透明细胞癌患者邻近肾组织中肾组织中NRG的免疫组织化学染色（图10G），证实NRG在ANCA-GN中明显过度表达，可能在ANCA-GN中发挥重要作用。

研究总结：本研究通过全面的生物信息学分析系统地探索了ANCA-GN的潜在机制。与此同时，这项研究还筛选了一些关键基因和重要通路，这可能有助于在ANCA-GN中找到新的生物标志物或治疗靶点。为了更有针对性地探索ANCA-GN的病理生理机制，还需要进一步的动物和临床分子生物学实验来验证这项研究的结果。