卓颖&钟霞Anal. Chem.：纳米限制电化学发光定量5-甲基胞嘧啶和5-羟基甲基胞嘧啶！

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研究内容

5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）是哺乳动物基因组中最丰富的两个表观遗传标记，已经证明，这些双重表观遗传标志比单个标记更能准确预测癌症的复发和存活。然而，由于5mC和5hmC的结构相似且低表达，区分和量化这两种甲基化修饰具有挑战性。

西南大学卓颖和钟霞使用十个十一位易位家族的双加氧酶（TET）通过特定的标记过程将5mC转化为5hmC，实现了基于纳米限制电化学发光（ECL）平台的两个标记的识别，并结合了重组酶聚合酶扩增（RPA）辅助的CRISPR/Cas13a系统的扩增策略。得益于TET介导的转化策略，开发了一种高度一致的标记途径来识别随机序列上的双重表观遗传标记，有效地减少了系统误差。所提出的生物分析策略可用于分别鉴定和定量100 aM至100 pM范围内的5mC和5hmC，这为早期诊断与异常甲基化相关的疾病提供了一个很有前途的工具。相关工作以“Identification and Quantification of 5‑Methylcytosine and 5‑Hydroxymethylcytosine on Random DNA Sequences by a Nanoconfined Electrochemiluminescence Platform”为题发表在国际著名期刊Analytical Chemistry上。

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研究要点

要点1. 作者首先通过制备碳化聚合物点嵌入SiO₂纳米网络建立了ECL平台（CPDs@SiO₂），由于纳米约束增强的ECL效应，与散射发射体相比，其表现出更高的ECL效率和更稳定的ECL性能。

要点2. 首先，用dsDNA模板特异性标记5hmC位点，并通过RPA扩增和T7转录转化为实质性的RNA激活剂，这将在与crRNA结合时触发CRISPR/Cas13a的跨切活性，从而不加区分地切割猝灭探针，导致用于定量5hmC的ECL信号恢复。然后，我们使用TET通过一锅法预先将5mC氧化为5hmC，以检测是否存在5mC位点，然后根据上述5hmC的标记、扩增和检测步骤，可以获得由5mC引起的信号值。

要点3. 无论样品中是否同时含有5mC和5hmC，都可以在以下过程中进行鉴定和定量。该生物分析策略可用于分别鉴定和定量100 aM至100 pM范围内的5mC和5hmC。

5mC和5hmC的高度一致的标记途径减少了由不同标记途径引起的系统误差，不仅实现了5mC和5hmC检测的高准确性，而且为通过ECL平台识别和量化多个甲基化位点提供了一种新的方法。

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研究图文

图1.（A）CPDs@SiO₂的合成过程示意图。（B）通过RPA辅助的CRISPR/Cas13a策略将5hmC/5mC位点转化为二级靶标以及（C）用于5mC和5hmC检测的ECL生物传感器的制造。

图2.（A，B）CPDs和（C）CPDs@SiO₂的TEM。（D）CPDs@SiO₂完整区域和（E）Si 2p区的XPS光谱。（F）CPDs@SiO₂可能的结构形成示意图。

图3.（A）CPDs@SiO₂在含有100 mM S₂O₈^2-的2 mL PBS溶液中，在-2.0至0 V的电势下的三维ECL光谱。（B）CPDs@SiO₂的FL（a）和ECL发射光谱（b）的比较。（C）CPDs@SiO₂（a）和CPDs（b）在800 V光电倍增管高压下的FL光谱（插图：（a）CPDs@SiO₂以及（b）CPDs在365 nm UV光下的图像）。（D）CPDs（a）和CPDs@SiO₂（b）的ECL强度比较。

图4.（A）S1-S2和T_N3-T′点击化学反应的PAGE图像。泳道1，正向引物；泳道2，反向引物；泳道3，RPA扩增产物；泳道4，S1-S2；泳道5，T-T′；泳道6，T_N3-T′；泳道7，S1-S2+T-T′。（B）Fc探针形成的PAGE图像。泳道1-4分别代表RNA2、S4、S3和Fc探针（所有寡核苷酸的浓度均为1 μM）。（C）TET1的氧化活性。没有（a）和有（b）TET1蛋白的反应的ECL信号的比较。（D）TET1氧化产物的拉曼光谱。

图5. 生物传感器在不同浓度（A）5hmC和（B）5mC下的ECL强度-时间曲线：(a) 100 aM, (b) 1 fM, (c) 10 fM, (d) 100 fM, (e) 1 pM, (f) 10 pM, (g) 100 pM。不同（C）5hmC和（D）5mC浓度的ECL强度和对数值的校准图。（E）5hmC生物传感器平台的选择性：（a）空白，（b）10 pM 5mC-dsDNA，（c）10 pM-c-dsDNA和（d）10 pM 5hmC-dsDNA。（F）5mC生物传感器平台的选择性：（a）空白，（b）10 pM C-dsDNA，和（C）10 pM-5mC-dsDNA。

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文献详情

Identification and Quantification of 5‑Methylcytosine and 5‑Hydroxymethylcytosine on Random DNA Sequences by a Nanoconfined Electrochemiluminescence Platform

Mao-Hua Gao, Mei-Chen Pan, Pu Zhang, Wen-Bin Liang, Xia Zhong,* Ying Zhuo*

Anal. Chem.

DOI: https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c01252