田阳/张琪伟JACS：亚100 ms超快检测和近红外荧光检测大脑中去甲肾上腺素！

研究内容

         

去甲肾上腺素(NE)是中枢和交感神经系统中的一种关键神经递质，在不同的生理和病理生理过程中，其含量在大脑各区域动态而快速地波动。然而，以高精度、特异性、敏感性，特别是高时间分辨率，直接可视化和精确量化生命系统中的瞬态NE动力学仍然是一个巨大的挑战。

         

华东师范大学田阳和张琪伟开发了一系列小分子探针，可以通过顺序的亲核取代-环化反应，伴随着比率近红外荧光响应，在60毫秒的极短时间内特异性检测NE，比现有的小分子探针快3个数量级。该独特的水促进分子间质子转移机制将识别动力学显著提高了约680倍。作者在单个活神经元水平上定量成像了外部刺激下的短暂内源性NE动力学，并在急性脑切片和活体小鼠脑水平上进一步揭示了NE波动与帕金森病病理之间的密切相关性。相关工作以“Sub-100 ms Level Ultrafast Detection and Near-Infrared Ratiometric Fluorescence Imaging of Norepinephrine in Live Neurons and Brains”为题发表在国际著名期刊Journal of the American Chemical Society上。

         

研究要点

         

要点1. 作者设计并合成了一套小分子荧光探针(5a/5b-8a/8b)，不仅对NE表现出优于EP和DA的优异选择性，而且还具有优异的近红外(NIR)激发和近红外双发射光学特性，可实现近红外比率传感和定量荧光成像。

         

要点2. 该探针在100 ms的时间尺度上实现了NE的超快检测，通过对NE触发组进行替代工程，可以将其进一步减少到60 ms。这是迄今为止报道的基于小分子探针的NE传感最快速的响应时间，能够定量监测和成像活神经元中的NE动力学。

         

要点3. 基于所开发的探针具有优异的特性，包括高特异性、纳摩尔灵敏度、比率荧光响应和高时间分辨率，代表性探针5a成功应用于实时定量成像和跟踪外部电或化学刺激下活神经元的瞬态NE动态。得益于探针激发和双发射的NIR窗口的深层组织穿透，被进一步用于检测PD模型下急性脑切片和活体小鼠脑中的NE变化，为NE相关的病理机制和PD的抗氧化治疗提供了分子水平的见解。

         

研究图文

         

图1.（A）探针对NE的分子设计和传感机制示意图。（B）探针5a/5b-8a/8b的合成路线。

图2.（A）5a-8a和5b-8b(5 μM)在PBS缓冲液(10 mM，pH=7.4)中的荧光光谱。（B）添加NE(0-70 μM)后，5a(5 μM)的紫外-可见-近红外吸收光谱。插图：添加NE(70 μM)前(左)后(右)样品溶液的照片。（C）添加NE(0-70 μM)后，5a(5 μM) 在650 nm处激发的荧光光谱。插图：添加NE(70 μM)前(左)后(右)样品溶液的近红外荧光图像。（D）添加NE(0-70 μM)后，5a(5 μM)的荧光强度比(F₇₁₀/F₈₀₅)曲线图和线性拟合。（E）探针5a(5 μM)对NE(100 μM)和其他神经递质(DA、EP、NE、5-HT、GABA，100 μM)、氨基酸(Ser、Thr、Lys，100 μM)、Hcy(20 μM)、Cys(200 μM)和GSH(500 μM)的选择性。（F）(i)NE、(ii)5a、(iii)5a与NE反应的混合物和(iv)4a的HPLC光谱。（G）在水溶液中，5a与NE反应产物的HR-MS光谱。（H）4a和5a的前沿分子轨道和相对能量。（I和J）5a和5a+NE的瞬态吸收光谱，[5a]=5 μM，[NE]=100 μM。（K和L）5a和5a+NE的680 nm激发的时间分辨吸收光谱的全局分析的主光谱分量。

图3.（A）5a(5 μM)在不同水分数的乙腈-水混合溶剂中对NE(50 μM)的反应动力学。荧光强度在710 nm处被记录并且在650 nm处被激发。（B）5a-8a(5 μM)对PBS(10 mM，pH 7.4)中50 μM NE的动力学荧光响应。根据ln[(F_max-F_t）/F_max]与时间的关系图斜率获得伪一阶速率常数(k_obs)。F_max是测量时间内的最大荧光强度，F_t是相应时间点的荧光强度(λ_ex=650 nm)。（C）5a和NE之间的反应过程中的途径、可能的过渡态和计算的结构相对能量。（D）5a/5b-8a/8b(5 μM)在PBS(10 mM，pH 7.4)中与NE(50 μM)的反应动力学。在710 nm处记录荧光强度，在650 nm处激发。（E）5a-8a和NE之间的亲核取代过程中，计算出可能的反应坐标的相对能量。

图4.（A）正常活神经元和用DSF+IPA(每个1 mM)或不同浓度的外源性NE处理1小时的神经元的共聚焦荧光显微镜图像，然后将每组与5a(5 μM)孵育10分钟。激发波长为650 nm。比例尺=25 μm。（B）与A相对应的相对荧光比率(F₇₁₀/F₈₀₅)的直方图。

图5.（A、B和C）电刺激、高浓度钾(90 mM)或NAC(1 mM)孵育刺激的5a孵育神经元的延时共聚焦荧光图像。激发波长为650 nm。比例尺为25 μm。（D、E和F）A、B和C的荧光强度比(F₇₁₀/F₈₀₅)的时间过程。比例尺表示25 μm。

图6.（A）正常和PD模型小鼠大脑的CA1、S1BF、LD和CPu区域以及NAC处理的PD模型小鼠脑的5a孵育组织切片的荧光比(F₇₁₀/F₈₀₅)图像。比例尺表示50 μm。（B）A中神经元的相应荧光比率(F₇₁₀/F₈₀₅)变化的直方图。（C）5a染色的正常、PD模型和NAC处理的PD模型小鼠大脑的体内成像。（D）C中大脑相对荧光变化的直方图。

         

文献详情

         

Sub-100 ms Level Ultrafast Detection and Near-Infrared Ratiometric Fluorescence Imaging of Norepinephrine in Live Neurons and Brains

Yujie Han, Leiwen Mao, Qi-Wei Zhang,* Yang Tian*

J. Am. Chem. Soc.

DOI: https://doi.org/10.1021/jacs.3c09239