巢晖Anal. Chem.：内源性NO产物N2O3和ONOO-双光子磷光寿命成像！

研究内容

            

一氧化氮(NO)是一种普遍存在的基本信号分子，参与对生理和病理过程的复杂影响。NO由一氧化氮合酶(NOS)生物合成或由亚硝酸盐产生，可通过氧化形成亚硝化试剂N₂O₃(4NO+O₂=2N₂O₃)或通过与超氧阴离子(·O₂^-)反应快速产生过氧亚硝酸根阴离子ONOO^-(NO+·O₂^-=ONOO^-)。然而，大多数现有的NO发光探针只关注特异性，仅利用单一信号来区分产物N₂O₃或ONOO^-。在目前的大多数工作中，他们仅仅通过荧光信号或荧光强度来区分一种产物和另一种产物，这不足以准确区分活细胞中NO的行为。

            

中山大学巢晖设计了一种新的线粒体靶向双光子近红外(NIR)磷光铱(III)复合物(Ir-NBD)，用于准确检测和同时成像内源性NO的两种下游产物，即N₂O₃和ONOO^-。Ir-NBD对N₂O₃和ONOO^-表现出快速响应，磷光强度增强，磷光寿命延长，双光子截面异常高，反应后分别达到78和85 GM。作者采用了多种成像方法，磷光强度成像和磷光寿命成像，通过探针Ir-NBD对N₂O₃和ONOO^-进行成像甚至区分。相关工作以“A Mitochondria-Localized Iridium(III) Complex for Simultaneous Two-Photon Phosphorescence Lifetime Imaging of Downstream Products N₂O₃ and ONOO^- of Endogenous Nitric Oxide”为题发表在国际著名期刊Analytical Chemistry上。    

            

研究要点

            

要点1. 作者通过融合N₂O₃结合的邻二胺基团、ONOO^-响应的芳香仲胺基团和铱基复合物，构建了一种新的双光子激发下的线粒体靶向近红外磷光探针(Ir-NBD)。Ir-NBD不仅能同时监测N₂O₃(NO/O₂)和ONOO-，而且还使用磷光寿命成像来区分它们。

            

要点2. 对于荧光信号，两种下游产物都能快速响应Ir-NBD，荧光强度显著增加；在磷光寿命方面，由于寿命的不同，二者呈现出不同的赝色，用眼睛很容易分辨出来。这是第一个能够同时检测N₂O₃和ONOO-作为NO的两个下游产物的近红外发光探针。

            

要点3. 作者进一步证实探针Ir-NBD在RAW 264.7细胞、HeLa细胞和斑马鱼的应用。Ir-NBD凭借其出色的光度计，通过荧光信号和磷光寿命成像，在脂多糖刺激的巨噬细胞模型中对N₂O₃和ONOO-作出反应，能够准确检测细胞内NO的基础水平，准确揭示细胞环境中炎症过程中内源性线粒体NO的分布。

                

这种创新的方法能够生动地观察NO在巨噬细胞线粒体内的动态分布。这些发现表明，探针Ir-NBD在提供与NO相关的生理和病理功能的更灵敏和可靠的研究方面具有巨大的潜力。

            

研究图文

            

图1.（A）之前关于N₂O₃的报告，（B）之前关于ONOO^-探针的报告以及（C）NIR探针Ir-NBD与N₂O₃和ONOO^-之间的响应机制的示意图。    

图2. 与Ir-NBD在各种条件下的磷光特性相关的一整套实验和数据。    

图3. 添加LPS 0、10、20、30、40和60分钟后，负载5 μM Ir-NBD的RAW 264.7细胞（A）和斑马鱼（C）的双光子磷光强度图像。（B，D）在RAW 264.7细胞（A）和斑马鱼（C）中磷光强度的定量。TPM：λ_ex=730 nm，λ_em=690-720 nm。比例尺：10 μm(RAW 264.7细胞)，200 μm(斑马鱼)。    

图4. 添加SIN-1(1)和（4）以及DEA-NONOate(3)和(6)后，负载5μM Ir-NBD的HeLa和RAW 264.7细胞（A，C）中的磷光寿命图像。（B，D）HeLa（A）和RAW264.7（C）中，Ir-NBD的磷光寿命和SIN-1和DEA-NONOate的分布。TPM：λ_ex=730 nm。比例尺：10 μm。    

图5. 在添加LPS 60分钟后，加载5 μM Ir-NBD的RAW 264.7细胞（D）中具有不同衰变时间的时间门控图像。（A）RAW 264-7细胞中的磷光寿命图像。（B）（A）的突出显示区域；（C）在RAW 264.7细胞中Ir-NBD对LPS诱导的磷光寿命和分布（A）。TPM：λ_ex=730 nm。比例尺：10 μm(RAW 264.7细胞)。    

图6. 添加LPS 60分钟后，负载5 μM Ir-NBD的斑马鱼（D）中具有不同衰变时间的时间门控图像。斑马鱼的磷光寿命图像（A）。（B）（A）的突出显示区域；（C）斑马鱼的磷光寿命和Ir-NBD向LPS的分布（A）。TPM：λ_ex=730 nm。比例尺：200 μm(斑马鱼)。

            

文献详情

          

A Mitochondria-Localized Iridium(III) Complex for Simultaneous Two-Photon Phosphorescence Lifetime Imaging of Downstream Products N₂O₃ and ONOO^- of Endogenous Nitric Oxide

Weijun Wu, Yuxin Wen, Yu Chen, Liangnian Ji, Hui Chao*

Anal. Chem.

DOI: https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c03023