目的 建立一种快速、灵敏且检测范围广的HPLC法测定人血浆中万古霉素的浓度，为临床万古霉素血药浓度监测、个体化给药及指导用药提供依剧。方法 在不同流动相配比、沉淀剂及柱温条件下，高效液相色谱法测定人血浆中万古霉素，确定最佳的色谱条件和操作方法。采用外标法定量，色谱柱：Agilent TC-C18 5u(150mm*4.6mm)；流动相：9%乙腈-91%磷酸二氢钾（PH3.2）；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；检测波长：236nm；进样量：20ul。结果 分析方法的线性范围为4.69~300.16mg/L，回归方程为Y=10526X-10533（r=0.9998，n=6），万古霉素的低、中、高（9.38、37.52、150.08mg/L）3种浓度的提取回收率介于90%~110%之间，日内及日间精密度的RSD均小于6%。结论 本方法操作简便、快速、准确灵敏，适用于临床万古霉素的血药浓度监测。
关键词：万古霉素，高效液相色谱法，血药浓度
Determination of vancomycin concentration in human plasma by HPLC
Objective: To establish a fast,and sensitive detection of a wide range of HPLC method for the determination of vancomycin in human serum concentration,clinical vancomycin blood drug concentration monitoring,individual to provide the basis for drugs and medication guide. Methods: Chromatographic peaks of serum vancomycin concentration under different mobile phase,precipitant and column temperature were analyzed to find the best chromatographic condition and operation method.Using the external standard method,column chromatography:Agilent TC-C18 5u(150mm*4.6mm),the mobile phase:9% acetonitrile-91% potassium dihydrogen phosphate(PH3.2),the flow rate:1.0ml/min,the column temperature:25℃,the detection wavelength:236nm,and the amount of sample:20ul. Results: The linear range of quantification of serum vancomycin was 4.69~300.16mg/L.The regress equations was Y=10526X-10533（r=0.9998，n=6）,The extraction recovery of vancomycin in low,medium and high concentrations(9.38、37.52、150.08mg/L)were all between 90%~110%.The inter-day and intra-day relative standard deviations (RSD) were less than 6%. Conclusion: The method is simple,rapid,accurate and sensitive,and suitable for clinical monitoring of blood concentration of voriconazole.
Key words: vancomycin;HPLC;blood drug concentration
万古霉素（Vancomycin）是一种三环糖肽类抗生素，对革兰阳性球菌有强大的抗菌作用，特别是对于目前临床上较为棘手的严重耐药金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌所致的感染有较好的疗效[1]。万古霉素于1958年被批准用于临床使用，因其在严重感染中具有重要地位，因此，万古霉素曾被誉为“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”，通常在其他抗菌药物无效时才应用[2]。其主要的给药方式是静脉给药，90%以上由肾脏排泄，万古霉素的抑菌机制之一是通过其七肽骨架与细菌细胞壁糖蛋白合成启动子——胞壁酰五肽的末端二肽片段D-Ala-D-Lac形成五个氢键来抑制细菌细胞壁的生长，从而导致细菌细胞凋亡[3]。随着万古霉素的大量使用，其不良反应时有发生。万古霉素的耳、肾毒性限制了其临床应用，剂量过大服用药过多和肾功能不全或老年患者更易发生耳肾毒性，因此应用时必须严格控制给药剂量并监测血药浓度[4]。目前国内外对万古霉素的血药浓度监测多采用免疫检测法、微生物法、高效液相色谱法等[5]。
1实验材料
1.1试剂
乙腈（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20140101）；
磷酸二氢钾（分析纯，广东光华科技股份有限公司，批号：20111129）；
三氯醋酸（分析纯，湖南汇虹试剂有限公司，批号：20140623）；
磷酸（色谱纯，上海士锋生物科技有限公司，批号：T13200-500）；
灭菌注射用水（安徽双鹤药业有限责任公司，批号k17062107）；
万古霉素标准品（中国药品生物制品检定所，批号：130338-200303）
1.2 仪器与设备
HITACHI高效液相色谱仪（日立高新技术公司）；
AJXDC-10氮气吹扫仪（上海净信实业发展有限公司）；
FA114A电子天平(万分之一)（上海海康电子仪器厂）；
雷磁PHS-3C型PH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；
TDL-80-2B低速台式离心机（上海安亭科学仪器）；
HMS-350涡旋震荡器（天津市威仪科技发展有限公司）；
Lenovo微型计算机（新圆梦F2028）（北京联想有限公司）；
微量进样器MC20µl（上海安亭微量进样器厂）
2实验方法选择
2.1 流动相的考察
本实验结合参考文献，最终选择流动相为91%磷酸二氢钾：9%乙腈(ph=3.22)。峰型良好，且无杂质峰干扰。色谱图如下：
图1- 91%磷酸二氢钾：9%乙腈(ph=3.22)
2.1 外标法的选择
目前国内文献多为内标法测定万古霉素血药浓度，而去甲万古霉素、维生素B等内标物多为临床常用药，若患者同时使用万古霉素和内标物质，内标物质可能作为内源性杂质干扰检测结果，不能准确计算万古霉素血药浓度，因此本实验采取更为简便的外标法检测结果。
2.2 血样预处理的选择
万古霉素的提取方案有多种，国外多采用固相提取和在线提取，在线提取对仪器要求较高，本实验采用10%三氯醋酸对样品进行蛋白沉淀，得到很好的分离条件，因此确定为本实验血样处理方案，
图2-三氯醋酸处理
3方法与结果
3.1血浆的来源
采集健康体检者的静脉血，离心后，取上层清液用于制备空白血浆，备用。采集静脉给予万古霉素进行治疗的患者的静脉血，离心后，取上层清液备用，作为患者血浆样品。
3.2色谱条件
色谱柱：Agilent TC-C18 5u(150mm*4.6mm)；流动相：9%乙腈-91%磷酸二氢钾（PH3.2）；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；检测波长：236nm；进样量：20ul；采集时间：30min。
3.3万古霉素对照品溶液
精密称取万古霉素对照品56.3mg于50mL量瓶中，用注射灭菌用水溶解定容至刻度线，配制成浓度为1126mg/L的万古霉素对照品储备液，置于冰箱4℃冷藏保存备用。
3.4血浆样品的处理
将病人血样以3500r/min离心5min后，吸取上层血清150uL于离心管中，10%三氯醋酸40uL，漩涡震荡3min，13000r/min离心12min后，取上清液20uL进样，在上述色谱条件下测定，记录万古霉素的峰面积。
4方法学验证
4.1标准曲线与线性范围
取空白血浆100uL，置于试管中，精密量取不同质量浓度、相同体积的万古霉素对照品稀释储备液50uL，混匀，制备成浓度分别为4.69、9.38、18.76、37.52、75.04、300.16mg/L的系列标准血浆样品，按“血浆样品的处理”项下方法操作测定，经HPLC分析，记录色谱图，测定结果如下表1。
表1 万古霉素进样浓度与峰面积关系(n=6)
进样浓度（mg/L） | 4.69 | 9.38 | 18.76 | 37.52 | 75.04 | 300.16 |
峰面积 | 35909 | 89186 | 175022 | 369973 | 813590 | 3142869 |
表 1 以万古霉素进样浓度(mg/L)为横坐标(X)，峰面积 (A)为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。计算回归方程为 Y=10526X+10533，r=0.9998。结果表明，绿原酸在4.69~300.16mg/L 范围内有良好的线性关系(图3)。
图3
4.2方法的专属性
分别取空白血浆和含药血浆样品，每个浓度各配制5份，按“血浆样品的处理”项下进行处理，测得色谱图。
图4-空白血浆
图5-含药血浆
4.3相对回收率试验
取空白血浆，加入已知浓度的万古霉素对照品，配制成浓度分别为9.38、37.52、150.08mg/L的血浆样品各5份，按“血浆样品的处理”项下进行处理，测得回收率。精密度用相对标准差RSD（RSD=SD/平均值*100%）表示，提取回收率用测得平均浓度/实际浓度*100表示。结果显示（表2），提取回收率分别为107.02%，91.18%，106.56%。
表2提取回收率实验结果
加样浓度（mg/mL） | 测得浓度（mg/mL） | 平均测得浓度（mg/mL） | SD | RSD(%) | 回收率(%) |
9.38 | 10.18 | 10.04 | 0.20 | 1.97 | 107.02 |
9.80 | |||||
10.29 | |||||
9.92 | |||||
10.00 | |||||
37.52 | 33.68 | 34.21 | 0.77 | 2.25 | 91.18 |
33.56 | |||||
35.11 | |||||
33.72 | |||||
34.99 | |||||
150.08 | 162.22 | 159.92 | 3.76 | 2.35 | 106.56 |
161.06 | |||||
156.79 | |||||
164.25 | |||||
155.28 |
4.4精密度试验
配制9.38、37.52、150.08mg/L的万古霉素血浆样品各5份，作为一批精密度样品，按“血浆样品的处理”项下进行处理，测得峰面积。以一日内每个浓度5个样品测得的万古霉素浓度计算日内精密度，每天制备上述浓度血样各5份连续测定3日，得日间精密度。
表3万古霉素批内、批间精密度（n=5）
加样浓度（mg/mL） | 测得浓度（mg/mL） | 平均浓度 （mg/mL） | SD | RSD(%) | |||||
第1日 | 9.38 | 10.18 | 9.80 | 10.29 | 9.92 | 10.00 | 10.04 | 0.20 | 1.97 |
37.52 | 33.68 | 33.56 | 35.11 | 33.72 | 34.99 | 34.21 | 0.77 | 2.25 | |
150.08 | 155.28 | 162.22 | 161.06 | 156.80 | 164.25 | 159.92 | 3.76 | 2.35 | |
第2日 | 9.38 | 8.69 | 9.27 | 8.96 | 9.80 | 9.18 | 9.18 | 0.41 | 4.49 |
37.52 | 35.84 | 36.15 | 33.68 | 37.01 | 39.27 | 36.39 | 2.02 | 5.56 | |
150.08 | 147.56 | 148.27 | 155.28 | 158.46 | 142.79 | 150.47 | 6.31 | 4.19 | |
第3日 | 9.38 | 9.44 | 10.02 | 9.35 | 9.76 | 8.99 | 9.51 | 0.39 | 4.15 |
37.52 | 35.22 | 36.18 | 39.40 | 34.98 | 39.34 | 37.02 | 2.19 | 5.91 | |
150.08 | 155.28 | 153.27 | 156.08 | 147.28 | 151.97 | 152.78 | 3.47 | 2.27 | |
4.5稳定性试验
将万古霉素的低、中、高浓度的血浆样品避光放置在4℃的冰箱中冷冻0h,24h,48h，样品经不同条件保存后按“血浆样品的处理”项下操作进行稳定性考察，结果显示（表4），精密度达到要求，但随着时间的延长，万古霉素会降解。
表4 万古霉素稳定性考察（n=5）
加样浓度 （mg/mL） | 测得浓度（mg/mL） | 平均浓度 （mg/mL） | SD | RSD | ||
0h | 24h | 48h | ||||
9.38 | 8.17 | 8.18 | 8.25 | 8.20 | 0.04 | 0.53 |
37.52 | 39.64 | 39.23 | 39.37 | 39.41 | 0.21 | 0.53 |
150.08 | 132.58 | 134.51 | 137.26 | 134.78 | 2.35 | 1.74 |
5讨论
本实验建立的HPLC法测定人血清中万古霉素的血药浓度，在4.69~300.16mg/L范围内线性关系良好；方法回收率均大于95%，精密度试验、稳定性试验等的RSD也在规定范围之内，符合《中国药典》中生物样品测定的要求。本方法具有灵敏、准确、测定成本低、操作简便等优点，适用于人血清中万古霉素血药浓度监测，有利于患者个性化治疗的安全实施，为临床用药剂量和给药方案调整提供重要参考依据。
参考文献
[1] 宋新文,许琼,汪洋,张华年,徐华.HPLC法测定人血清中万古霉素的浓度[J].中国药房,2010,21(18):1663-1665.
[2] 董沫含. 万古霉素用于临床危重患者的规范化用药管理研究[D].,2016.
[3] 陈玉岩. 万古霉素动态组合化学研究[D].中国协和医科大学,2007.
[4] 彭芳辰,李颖,白小红.高效液相色谱法测定人血清中万古霉素的浓度[J].中国药物与临床,2011,11(06):667-668.
[5] 林玉仙,苏煌财.高效液相色谱法测定万古霉素的血药浓度[J].中国医院药学杂志,2009,29(08):637-639.
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