从实验设计的思路解析山东卷25题（含视频详解）

（2021·山东卷）25.（12分）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。

（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是______，在R末端添加的序列所对应的限制酶是_______。本实验中,从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要______种酶。

解析：首先我们把这个题目定位为实验设计题。

实验目的：确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置（换句话说，就是确定BCL11A蛋白到底与F1～F7中的哪个片段结合）。  

实验原理：F1～F7片段结合在荧光蛋白基因的上游，一旦BCL11A蛋白与F1～F7中的某个片段结合，荧光蛋白的基因表达就会被抑制，从而模拟了γ基因的表达被抑制的情境。

实验步骤：（1）扩增了γ基因上游不同长度的片段，即通过PCR技术分别扩增F1～F7片段；

（2）构建重组DNA分子：让F1～F7片段分别与表达载体重组。（因此需要用限制性核酸内切酶处理表达载体和扩增的F1～F7片段，为了保障重组的顺利完成，要用限制酶切除相同的粘性末端，当然最后用两种限制酶，这样可以避免环化）

（3）将重组DNA分子导入受体细胞，通过荧光蛋白基因是否表达，来判断BCL11A蛋白到底与F1～F7中的哪个片段结合。  

 这里需要说明的两点是：①将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞；②表达载体上的BCL11A基因要表达的前提是雌激素的存在；

视频详解

（2）将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是___________________________。

（3）向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于___________，理由是_______________________________________________。

【答案】（1）SalⅠ     EcoRⅠ     6

（2）F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达

（3）引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上     根据有无荧光情况判断，F1～F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上