中药复方配伍理论下生血宝复方化学成分溶出规律研究

中药复方配伍是中医施治的主要方式，为几千年用药沿革的鲜明特色[1]。中医讲究理法方药、辨证论治，通过中药合理配伍实现临床个体化用药目的[2]。“君臣佐使”源于《神农本草经》，古人借“君臣佐使”理清中药复方中各单味药的主次和相互关系，针对不同证候发挥不同作用以达到辨证论治目的[3]。中药方剂的“君臣佐使”表现在：以其中的君药为主要物质基础发挥主要功效，而臣佐使药协助与调和以达到最佳功效与治疗目的[4]。

复方发挥功效的微观物质基础是中药化学成分，中药化学成分从形成到进入机体发挥疗效历经了几个阶段：第1阶段为自然生长或经炮制加工所形成中药及饮片，其物质形态是源头与基础，通过采收天然生长或者种植加工后或经炮制获得；第2阶段为中药剂型单元操作所形成的中间体或者制剂，其物质形态通过配伍组方后经制剂单元操作而成；第3阶段则是进入体循环至靶点发挥作用时的中药成分群（显效形式），其物质形态通过机体的ADME（吸收、分布、代谢、排泄）过程形成后发挥功效。

中药复方配伍理论在中药成分从第1阶段到第2阶段的转变过程发挥了重要的指导作用，亦即复方中各单味药在不同的君臣佐使配伍下，其化学成分群的溶出情况不是简单的加减变化规律，与中药的“七情”配伍、“增溶助溶潜溶”以及形成超分子体有关。因此，本实验从不同配伍下中药汤剂的成分溶出情况探讨中药复方配伍理论背后的科学内涵。

生血宝复方由制何首乌、墨旱莲、桑椹、女贞子、白芍、黄芪、狗脊7味中药组成，其中以制何首乌为君，是补肝肾、益精血的滋补良药[5]，以墨旱莲、桑椹、女贞子为臣，滋补肝肾，以白芍、黄芪、狗脊为佐使[6]。目前，临床主要针对放、化疗所致的白细胞减少，缺铁性贫血、化疗后贫血等方向都具有良好的治疗效果[7-9]，也有选用生血宝合剂讨论辅助治疗新型冠状病毒肺炎的可行性研究分析[10]。近年来有基于质量源于设计（QbD）理念选择生血宝合剂进行研究，建立了高效液相色谱-紫 外-质谱联用（HPLC-UV-MS）定性定量方法[11]，也有采用HPLC-UV-MS分析法建立生血宝合剂有效含量测定的方法[12]，但并没有针对生血宝复方配伍理论以及单味药的对比性研究。

本研究从中药复方配伍理论出发，将生血宝复方按照“君臣佐使”的原则重新分成7个配伍，连同7个单味药一起进行其特征超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱分析，探究“君臣佐使”原则下，生血宝单味药、不同配伍及复方中的16种成分在 不同配伍下溶出情况及规律，分析中药配伍的关系与作用机制，阐明复方中君臣佐使关系的科学内 涵[13-14]，助力中医药现代化研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Acquity UPLC H-Class型超高效液相色谱仪，PDA检测器、四元梯度泵、自动进样装置、在线真空脱气装置、柱温箱、Empower3色谱工作站，美国Waters公司；MD205DU电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；SB·5200DTD型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；ZDHW型电热套，北京中兴伟业仪器有限公司。

1.2 试剂与药材

依据《中国药典》2020年版及相关文献查询结果[15-25]，选取16种对照品分别为毛蕊异黄酮苷（批号DST201220-013）、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O- β-D-葡萄糖苷（批号DST201021-061）、特女贞苷（批号DSTDT000901）、红景天苷（批号DST200425- 037）、蟛蜞菊内酯（批号DST210319-003）、旱莲苷A（批号DST200401-021）、木犀草苷（批号DST201102-016）、木犀草素（批号DSTDM003202）、白藜芦醇（批号DST200308-045）、原儿茶醛（批号DSTDY008001）、毛蕊异黄酮（批号DST200609- 012）、芒柄花黄素（批号DST201025-011）购于湖南乐美天生物科技有限公司；大黄素（批号110756- 200110）、大黄素甲醚（批号16070403）、原儿茶酸（批号110809-200604）购于中国食品药品鉴定研究院；芍药苷（批号L07M9Q60533）购于上海源叶生物科技有限公司，所有对照品质量分数均大于98.0%。甲醇（批号21075141）、乙腈（批号1903517）均为色谱纯，美国Tedia公司；磷酸（批号20190629- 2），分析纯，湖南汇虹试剂有限公司；水为怡宝纯净水；0.22 μm微孔滤膜（批号Y8101409），上海安谱实验科技有限公司。

制何首乌、黄芪、桑椹、女贞子、墨旱莲、白芍、狗脊购于湖南老百姓大药房，药材来源均为湖南药圣堂中药科技有限公司，批号分别为20201101、20210401、20210401、20201101、20210701、20210701、20201101，经湖南中医药大学中药鉴定教研室石继连教授鉴定，制何首乌为蓼科何首乌属植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.干燥块根的炮制加工品、黄芪为豆科黄芪属植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge. var. mongholicus Bge. Hsiao的干燥根、桑葚为桑科桑属植物桑Morus alba L.的干燥果穗、女贞子为木犀科女贞属植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实、墨旱莲为菊科鳢肠属植物鳢肠Eclipta prostrata L.的干燥地上部分、白芍为毛茛科芍药属植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根、狗脊为蚌壳蕨科金毛狗属植物金毛狗脊Cibotium barometz(L.) J. Sm.的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 生血宝复方及配伍组方供试品溶液的制备

依据《中国药典》2020年版，以君臣佐使原则，复方剂量严格按照药典“处方”内容，参考“制法”内容[15]，将生血宝复方七味药分为“君一臣三佐使三”后重组的7个配伍组方（表1），按表1进行配伍称取，剪碎，加8倍量水，浸泡20 min，再煎煮1.0 h，趁热抽滤药液，滤渣弃去，滤液减压浓缩至适量，获得其含生药量均为1.0 g/mL，得供试品溶液，备用。

2.1.2 单味药供试品溶液的制备

分别称取白芍、制何首乌、黄芪、桑椹、女贞子、墨旱莲、狗脊各4.0 g，剪碎，加8倍量水，浸泡20 min，再煎煮提取1.0 h，趁热抽滤药液，滤渣弃去，滤液浓缩至4.0 mL，得单味药供试品溶液，其生药量为1.0 g/mL。

2.1.3 对照品溶液的制备

分别精密称取对照品毛蕊异黄酮苷2.6 mg、毛蕊异黄酮2.9 mg、芒柄花素3.4 mg，置1 mL量瓶中，加甲醇溶液定容，即得；分别精密称取对照品2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O- β-D-葡萄糖苷0.4 mg、特女贞苷2.6 mg、红景天苷1.0 mg、蟛蜞菊内酯0.1 mg、旱莲苷A 6.2 mg、木犀草素0.7 mg、木犀草苷0.6 mg、白藜芦醇0.6 mg、原儿茶醛1.7 mg、大黄素3.5 mg、大黄素甲醚3.1 mg、芍药苷1.3 mg、原儿茶酸0.8 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶液定容，即得。取各对照品溶液各200 μL，制成混合对照品溶液。

2.2同时测定16种成分的方法学研究

2.2.1 色谱条件

Waters Acquity UPLC C18色谱柱T3（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相为0.05%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脱：0～54 min，26%乙腈；54～57 min，26%～35%乙腈；57～59 min，35%乙腈；59～75 min，80%乙腈；体积流量0.3 mL/min；柱温35 ℃；进样量1.0 μL；全波长扫描200～400 nm，图例显示选取波长220 nm。

2.2.2 UPLC图的建立

将配伍后的7个组方按照“2.1”项下方法制备供试品溶液，均按“2.2.1”项下条件进样，记录各供试品的色谱图。本研究初期针对生血宝复方中共20种对照品（例如芹菜素及山柰酚等）进行研究，但由于对照品数量巨大且部分对照品在水提液中含量过低等问题，故选取7单味药、7个配伍组方及16种对照品（木犀草素与毛蕊异黄酮保留时间相近，定量时通过分别选取不同最大吸收波长得以实现）的指纹图谱数据导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度软件评价系统（2012版）”，得图1。

2.2.3 线性关系考察

精密吸取“2.1.3”项下配制的混合对照品溶液适量进行稀释，以峰面积为横坐标（X），质量浓度为纵坐标（Y）进行线性回归，其回归方程和线性范围见表2。按照“2.2.1”条件进样，同时测定16个化合物含量，获得了16种对照品的良好线性方程与线性范围，线性关系良好（r≥ 0.999 5），其线性范围均满足本研究的含量测/定。

2.2.4 精密度试验

按照已经建立的UPLC分析条件，取“2.1.3”项下配制的混合对照品溶液，连续进样6次，记录色谱图。结果表明该方法的精密度符合要求，测得各相对峰面积RSD为2.75%～4.78%，说明仪器精密度良好。

2.2.5 稳定性试验

按“2.1.1”项下配制的复方汤剂供试品溶液，按上述色谱条件下分别于制备后0、4、8、16、24、48 h进样，获得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD为1.46%～4.55%，表明在48 h内供试品溶液稳定性良好。

2.2.6 重复性试验

按“2.1.1”项下方法平行配制复方汤剂供试品溶液6份，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，结果得质量分数的RSD为1.98%～4.88%，表明实验重复性较良好，结果表明方法的重复性在误差范围内。

2.2.7 加样回收率试验

取已测定各指标成分含量的复方汤剂供试品溶液9份，分为3组，分别按照已知浓度50%、100%、150% 3个水平加入各对照品溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，获得各对照品平均加样回归收率为96.4%～102.5%，RSD为0.66%～3.25%。

2.3 单一成分的溶出量测定

同时测定16种化合物在生血宝单味中药及7种配伍中的溶出量情况，从16种成分总溶出量可以明显看出，E（君＋佐使）的溶出量最大（2.956 3 mg/g），其次为G复方（2.884 6 mg/g），其结果列于表3。本研究中白藜芦醇在单味药及相应配伍中均未检测到。

从表3可以看出：①用本研究建立的方法从7个单味药与7种配伍中可以检出15种成分，分别存在于除桑椹以外的6味中药及配伍中。②可以明显看出与单味药相比，经复方配伍后溶出量明显减少的成分有：原儿茶酸、红景天苷、二苯乙烯苷、特女贞苷、蟛蜞菊内酯、旱莲苷A和大黄素；变化不明显的有：毛蕊异黄酮苷、木犀草素、大黄素甲醚；明显增加的有：原儿茶醛、芍药苷、木犀草苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素。③从16种成分溶出的总量来看，E（君＋佐使）的溶出量最大（2.956 3 mg/g），复方次之（2.884 6 mg/g），C（佐使）更次之（2.007 2 mg/g），佐使药（白芍、黄芪、狗脊）与君药配伍后有明显加强溶出量的作用。

但同时发现E（君＋佐使）总溶出量大于复方约0.07，其原因可能为在复方的复杂体系中，臣药的加入改变了煎煮过程中各化学成分体系的环境，在其中起到了调协配比的作用。从各单味中药来看，黄芪的溶出量最大（1.343 0mg/g），制何首乌（君药）次之（1.114 7 mg/g），女贞子更次之（0.781 0 mg/g）。

2.4 指纹图谱相似度分析

2.4.1 单味药与配伍之间的相似度分析 将各单味药及不同配伍样品的指纹图谱导入国家药典委员会开发的“中药色谱指纹图谱相似度软件评价系统（2012版）”，计算其相似度值。从表4可以看出，①各单味中药及其配伍的指纹图谱间的相似度都不大，说明相似度值可以客观反映其图谱样品来源的一致性；②与G（复方）相似度最高是D（君+臣），其值为0.767，其次是B（臣）、b（墨旱莲）、A（制何首乌），其相似度分别为0.754、0.711、0.701，其他均小于0.6。

2.4.2 总量统计矩参数及相似度评价系统

应用本团队前期创立的总量统计矩参数及相似度分析方法[26-29]，分析计算生血宝单、复方总量统计矩三参数及其相似度值，从表5可以看出总量零阶矩参数值排在前3的依次为F（臣＋佐使）、e（女贞子）和B（臣药）。表6可知D（君＋臣）/（A＋B）、E（君＋佐使）/（A＋C）、G（复方）/（A＋B＋C）的相似度分别为0.918，0.953和0.948；表7可知B（臣）/（b＋c＋d）、F（臣＋佐使）/（B＋C）的相似度分别为0.849，和0.925；表8可知C（佐使）/（e＋f＋g）的相似度为0.886。通过相似度可以发现单味药与其相应配伍指纹图谱相似度差异性较小，除臣药配伍总量统计矩中存在相似度值为0.798、0.773、0.747，其余均大于0.800；与复方相似度最高的为（君＋臣）配伍，为0.767，其次为臣药，值为0.754，其结果可以进一步佐证君臣相须的科学内容。其余结果列于表5～8。

3 讨论

生血宝复方是滋补肝肾、益气活血的良药。生血宝颗粒剂因其疗效显著被收录于《中国药典》2020年版中[15]，为湖南省中药产业发展的重要品种之一。其以制何首乌为君，墨旱莲、桑椹、女贞子为臣，白芍、黄芪、狗脊为佐使，7味药互相配伍共起滋补肝肾、生津养血之效，常用于肝肾不足、气血两虚所致的神疲乏力、腰膝痠软、头晕耳鸣等症状。本研究基于化学成分、药效等方面，严格考察《中国药典》2020年版及相关文献查询最终选取了7味药中16个单一化合物作为溶出情况研究对象，例如制何首乌中大黄素具有对脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤的保护作用[30]；桑葚中的白藜芦醇能够调控细胞炎症因子水平，修复细胞损伤[31]；墨旱莲中木犀草素具有明显的抗炎抗氧化作用等[32]。

众所周知，单一化合物的溶出情况不仅与本身及溶媒体系的理化性质有关，还与其所处的化学成分微环境有关。单纯的溶质与溶剂的关系遵循“相似相溶”规律，其溶解度大小由溶质与溶剂的溶度参数、溶剂的介电常数等综合决定；但倘若为复杂溶质或者混合溶剂，就会出现“增溶、助溶、潜溶”等复杂相互作用情况，其溶解情况将会偏离“相似相溶”理论[33-35]。因此，中药复方汤剂中检出很多中等极性或弱极性的成分，诸如本研究在生血宝汤剂中检出有蟛蜞菊内酯、芒柄花素、毛蕊异黄酮苷等脂溶性成分。

3.1 单一成分的溶出情况

本研究建立了同时测定16个单一化合物的方法学，作了相应含量测定，各组样品和含量测定在同样的提取、检测环境下，进行了3组重复验证，以保证其实验结果的正确性。

通过复方和单味药各化学成分对比可以发现，芍药苷、毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素溶出量都有了明显的增加，其中芍药苷具有促进造血功能、抗血栓作用[36]；毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素作为黄芪主要化学物质，具有显著的保护心脑血管、抗氧化等作用[37-38]，说明经过配伍煎煮后，相较于单味药，药理效应有了明显的加强。而各配伍组、单味药化学成分的变化更说明了中药化学成分在煎煮过程中的溶出情况会随着配伍变化而变化，其原因是中药复方配伍的变化直接改变了复杂溶质的构成比，从而改变了煎煮过程分散体系的化学微环境，使生血宝复方中16种成分溶出情况表现为以上3点规律，进而对复方配伍的药效产生了变化。

3.2 总响应成分的溶出情况

本研究从中药指纹图谱相似度定量分析总响应成分的溶出情况，采用中药色谱指纹图谱相似度软件评价系统（2012版）进行分析，针对各单位中药及其配伍进行相似度研究，发现相似度可以客观反映各配伍组方与其对应中药的一致性。观察可知君臣药与总复方的相似度最高，说明其与复方相似度的贡献率最大，而君药A的相似度低于臣药B，可能是因为A的效应指数（效量比）高，也暗示君臣药对比单用效果强得多；而同为臣药的桑葚、女贞子的相似度与墨旱莲的相似度为何相差如此之大，可能正是说明了对复方总溶出成分的贡献不一样，但最终对临床疗效的贡献还需要做进一步研究。本研究用总响应成分溶出定量数据初步证明了君臣相须、佐使相辅的科学内涵；

再者，本研究采用团队建立的总量统计矩及相似度分析方法进行了相关研究，生血宝复方G的总量零阶矩参数值并未排入前3，说明单味药单提溶出的成分在配伍时不会全部溶出，再经配伍组方后根据组方理论与用药目的选择性地溶出，且复方总成分溶出量并不一定是最多的；根据总量统计矩相似度分析方法具有加和性的特点，如果配伍前后溶出成分是一致的，通过加和性分析其相似度应该很高。这些实验数据进一步表明配伍前后中药成分溶出情况是不一致的，且与君臣佐使配伍规律有关。

总溶出量能从总体上反映复方的总体溶出情况，根据Hill量效关系，针对同一个中药复方，不同的总溶出量可以从总体上反映出整个复方的效应变化情况的，故本研究具有一定的现实意义。此外，本研究建立了运用UPLC法同时检测16种中药单一成分的定性定量方法，该方法简便易操作，重复性好，为生血宝复方质量综合评价提供了保障。本研究从中药成分溶出情况的角度阐释了中药复方生血宝配伍理论的科学内涵，揭示了不同配伍组方影响了其化学成分溶解度，七味中药通过君臣佐使配伍所得的生血宝复方实现了最大溶出度，以达到临床辨证论治的用药目的。故本研究为中医药现代化研究的提供了新思路与新方法。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：李世雄，赵思宇，李 源，何文婧，张喜利，刘文龙．中药复方配伍理论下生血宝复方化学成分溶出规律研究 [J]. 中草药, 2022, 53(14): 4298-4306 .