丹参-赤芍药对治疗结直肠癌的作用机制研究

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见的消化系统恶性肿瘤，在最新统计的全球癌症发病率和死亡率排名中均位居前列[1]，其高发病率和高死亡率严重威胁人们的生命健康。CRC的发生、发展机制复杂，其中涉及多种肿瘤相关基因及肿瘤相关信号通路的改变。

近年来，中药以其多途径、多靶点的优势，在辅助治疗CRC方面取得了良好的疗效。丹参-赤芍是临床上抑制恶性肿瘤发生发展常用的活血化瘀药对，其中，丹参是唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，《本草纲目》草部中记载其味苦，性微寒，无毒，归心、肝经，具有祛瘀生新、活血止痛的功效[2]。赤芍是为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍P. veitchii Lynch的干燥根，味苦，性微寒，归肝经，具有清热凉血、活血祛瘀的功效[3]。本研究基于网络药理学及分子对接技术筛选丹参-赤芍药对治疗CRC的相关靶点和通路，并将筛选后的活性成分与靶蛋白进行分子对接，探讨丹参-赤芍药对是否能够多靶点、多途径抑制CRC的发生发展，并运用体外细胞实验对相关靶点进行验证，以期为中医药防治CRC提供新思路。

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结果

丹参-赤芍药对活性成分及靶点的筛选

通过在TCMSP数据库中查找到丹参-赤芍的活性成分并按照筛选条件进行筛选，得到活性成分206个，药物作用靶基因352个。

CRC相关靶点筛选和药物-疾病交集靶点获取

将GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DurgBank数据库检索的CRC相关靶点结果合并，去除重复数据，筛选得到CRC相关靶点9143个，见图1。将丹参-赤芍药对的潜在靶点与CRC相关靶点取交集映射，利用Perl软件绘制韦恩图，共得到283个交集靶点，见图2。

“中药-活性成分-潜在治疗靶点”网络分析

将筛选后的丹参-赤芍活性成分、交集靶点以及中药信息导入Cytoscape 3.8.2软件进行可视化分析，获得“中药-活性成分-潜在治疗靶点”网络图，见图3。

PPI网络分析

将药物与疾病共有靶点导入STRING数据库，得到PPI网络（图4），共有131个节点、520条边。

使用插件CytoNCA提取网络中得分较高的节点，以介数和自由度的中位数作为截点，根据条件选择排名前11的靶点为ESR1、CTNNB1、RB1、特化蛋白1（specialized protein 1，SP1）、原癌基因SRC、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JUN）、信号传导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF1A）、周期依赖性激酶抑制剂1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）、细胞周期素D1（cyclin D1，CCND1），取排名前3的靶点即ESR1、CTNNB1、RB1作为关键靶点（图5），进行后续研究。

GO功能富集分析

根据R语言程序设定条件进行GO功能富集分析，富集结果按照P值从小到大排序，选取前10条GO条目输出气泡图。如图6所示，丹参-赤芍药对主要影响药物反应、氧化应激响应等生物过程（biological process，BP），影响膜筏、膜微域等细胞组分（cellular components，CC），参与酰胺结合、肽结合等分子功能（molecular function，MF）。

KEGG通路富集分析

分析药物与疾病共同靶点进行KEGG通路富集分析，根据P值进行排序，得到丹参-赤芍药对治疗CRC的相关通路30条，见图7。通过分析气泡图结果并结合肿瘤相关通路研究可知，丹参-赤芍药对治疗CRC的潜在靶点主要集中在磷脂酰肌醇3-激酶（
phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、p53信号通路、HIF-1信号通路、细胞凋亡等信号通路上。

丹参-赤芍活性成分与关键靶点的对接

根据PPI分析结果，选取度值排名前3的靶基因（ESR1、CTNNB1和RB1）所编码的靶蛋白（ESR1、β-catenin和RB1）与丹参-赤芍药对的活性成分进行分子对接，结果显示，丹参-赤芍药对中活性成分黄芩苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、木犀草素、芍药苷、二没食子酸、异欧前胡素、异隐丹参酮、泪柏醇、鞣花酸等与关键靶点对接稳定（表2）。对结果进一步分析发现，芍药内酯苷与ESR1结合能力较强，分别在LEU346、GLU353、ARG394形成H键，结合能为−67.481 kJ/mol；苯甲酰芍药苷与β-catenin结合能力较强，分别在SER448、ARG474形成H键，结合能为−37.983 9 kJ/mol；苯甲酰芍药苷与RB1结合能力较强，分别在LYS765、TYR756形成H键，结合能为−36.384 6 kJ/mol（图8）。

丹参-赤芍药对抑制HCT116细胞增殖

如表3所示，不同质量浓度的丹参-赤芍对HCT116细胞均有一定的抑制作用，且呈剂量相关性。运用SPSS 25.0统计软件计算出药物作用于HCT116细胞48 h的半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）为459.303 μg/mL。根据IC50值和本课题组前期实验，给药质量浓度选择在459.303 μg/mL以下。选择100、200、400 μg/mL的丹参-赤芍进行后续实验。

丹参-赤芍药对抑制HCT116细胞迁移

如图9所示，与对照组比较，各给药组细胞迁移率显著降低（P＜0.05、0.01），其中丹参-赤芍高剂量组作用最佳。

丹参-赤芍药对对HCT116细胞ESR1、CTNNB1和RB1 mRNA表达的影响

如图10所示，与对照组比较，丹参-赤芍药对各剂量组ESR1 mRNA表达水平显著降低（P＜0.05、0.01），丹参-赤芍药对高剂量组CTNNB1 mRNA表达水平显著降低（P＜0.01），丹参-赤芍药对中、高剂量组RB1 mRNA表达水平显著升高（P＜0.05）。

丹参-赤芍药对对HCT116细胞ESR1、β-catenin和RB1蛋白表达的影响

如图11所示，与对照组比较，丹参-赤芍药对各剂量组ESR1和β-catenin蛋白表达水平均显著降低，RB1蛋白表达水平明显升高（P＜0.05、0.01）。

丹参-赤芍药对HCT116细胞凋亡蛋白表达的影响

如图12所示，与对照组比较，丹参-赤芍药对高剂量组Caspase-3蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），丹参-赤芍药对中、高剂量组PARP蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）。

讨论

中医认为CRC病位在大肠，与脾胃密切相关。《灵枢·百病始生》提到：“肠胃之络伤，则血溢于肠外，肠外有寒，汁沫与血相抟，则并合凝聚不得散，而积成矣。”患者多因脾失健运，血行不畅，日久致瘀，瘀血搏结肠道，损伤肠络，日久成痈而致癌肿，常见腹痛拒按、舌质紫暗或有瘀斑、脉涩等临床表现，故临床治疗CRC多加入丹参、赤芍等活血类中药[8]。

本研究利用网络药理学，深入挖掘丹参-赤芍治疗CRC的有效成分、潜在靶点和作用机制。共筛选到丹参-赤芍药对的活性成分206个，丹参-赤芍药对治疗CRC的潜在靶点283个，并通过PPI网络分析筛选出ESR1、CTNNB1及RB1为关键核心靶点。其中，ESR1是CRC发生、发展和转移中最重要的调节基因，是诱导CRC的潜在机制[9]。一项基于GSCA的遗传改变分析表明，ESR1基因的突变可能是诱发CRC致癌的潜在机制，并且与生物学进展与免疫反应有关[10]。CTNNB1基因编码蛋白β-catenin是Wnt信号传导的关键组成部分，在CRC进展中起着至关重要的作用[11-12]。β-catenin在正常结直肠上皮组织中定位于细胞膜，而在癌变过程中β-catenin从细胞膜游离，在CRC癌组织中主要表达于细胞质和细胞核中。其在CRC癌组织中异常高表达与肿瘤的分化、侵袭、转移密切相关[13]。

研究显示，槲皮素、木犀草素、芹菜素等中药单体通过Wnt/β-catenin通路对CRC的不同阶段（包括癌前病变、CRC早期和晚期）发挥抗肿瘤作用[14]。β-catenin可能是CRC患者的临床预后的重要生物标志物。RB1是肿瘤抑制基因，RB1表达水平与肿瘤的大小、淋巴结转移及临床预后密切相关，RB1可以通过限制细胞周期进展从而抑制肿瘤的发展进程[15]。有研究发现RB1在前列腺癌、乳腺癌、CRC、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤进展过程中失活[15-18]。肿瘤细胞中的RB1缺失会诱导脂肪酸氧化并激活JNK，激活后的JNK通过刺激IL-6的产生，进而促进STAT3介导的干细胞样行为和恶性进展。也有研究分析发现，RB1是CRC发生晚期肝转移及腹膜转移的核心基因，并且可能与肿瘤浸润淋巴细胞相关途径有关[19]。

本研究通过MTT及划痕实验验证了丹参-赤芍药对对HCT116细胞的增殖和迁移能力具有明显的抑制作用，并且通过qRT-PCR及Western blotting实验分别在基因和蛋白水平验证了丹参-赤芍药对对网络药理学筛选出的核心基因ESR1及CTNNB1（编码蛋白β-catenin）的表达具有明显的抑制作用，对RB1表达具有明显的促进作用。因此，核心基因ESR1、CTNNB1及RB1有可能在丹参-赤芍药对抑制CRC发生发展过程中发挥了关键作用。

GO功能富集分析发现丹参-赤芍药对对药物反应、氧化应激等BP，膜筏、膜微域等CC，酰胺结合、肽结合等MF产生影响，并且KEGG通路富集分析得到丹参-赤芍药对主要通过PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、p53信号通路、HIF-1信号通路、细胞凋亡等信号通路抑制CRC的发生发展。其中PI3K/Akt是与肿瘤发生发展密切相关的信号通路，在调控CRC细胞增殖、侵袭、细胞周期等行为上发挥重要的作用。研究表明，HER2在CRC癌组织中的高表达水平与PI3K/Akt通路的激活有关，PI3K可以驱动HER2的表达，促进肿瘤干细胞增殖能力[20]。

杠柳次苷是一种潜在的抗癌化合物，研究发现杠柳次苷可以通过靶向PI3K/Akt通路，促进细胞凋亡来发挥抗CRC作用[21]。TNF-α是CRC中常见的促炎细胞因子，可通过激活JNK信号通路调节BaP和PhIP诱导的CRC上皮细胞DNA损伤。TNF-α诱导的DNA损伤又能被功能性p53抑制[22]。CRC中增强的糖酵解和磷酸戊糖途径与HIF-1α表达增加有关，活性氧（reactive oxygen species，ROS）/ PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信号激活HIF-1α诱导的代谢重编程，从而在CRC治疗过程中促进机体对5-氟尿嘧啶产生耐药性，降低临床疗效[23]。故PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、p53信号通路、HIF-1信号通路、细胞凋亡等信号通路与CRC的发生发展密切相关。

利用分子对接技术筛选出丹参-赤芍药对中有效成分黄芩苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、木犀草素、芍药苷等与关键核心靶点对接能力较强，这与本课题组前期进行的UPLC-Q-TOF/MF实验筛选出的药物有效成分相一致[4]。其中，黄芩苷介导了多种癌症相关信号通路的调节[24]，其可以通过上调孕酮诱导的蜕膜蛋白（DEPP）和激活Ras/Raf/丝裂原活化蛋白激酶（MEK）/细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号传导诱导CRC细胞的衰老[25]，也可以通过减少c-Myc的表达来诱导CRC细胞凋亡并抑制肿瘤生长[26]；芍药内酯苷可通过核因子-κB（NF-κB）/环氧化酶-2（COX-2）信号通路抑制溃疡性结肠炎大鼠发生炎症反应，抑制结肠组织氧化反应，减轻结肠组织病变，从而阻断CRC“炎-癌”转化进程[27]；苯甲酰芍药苷、木犀草素、芍药苷等也具有很好的抗肿瘤活性作用[28-30]。

综上所述，本研究基于网络药理学、分子对接技术及体外实验证明了丹参-赤芍药对能够通过多通路、多靶点在CRC治疗中发挥重要的作用，为丹参-赤芍药对治疗CRC提供了客观依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：王方园，王 栋，孔宪斌，时浩洋，赵 爽，杨玉莹，孟静岩．基于网络药理学和分子对接研究丹参-赤芍药对治疗结直肠癌的作用机制 [J]. 中草药, 2022, 53(18): 5731-5741 .