我与海马神经元的爱恨情仇之二
——原代培养海马神经元
上一篇文案里已经和大家吐槽了我的原代细胞,超级超级不好养,而且超级费钱,所有的经验教训简直可以写一本血泪史,今天就和大家一起分享一下我的原代细胞培养方法,希望能让大家避免走一些不必要的弯路,共同探讨学习。
原代细胞培养步骤需要准备的东西较多,步骤也比较繁琐,从组织的选择到细胞的培养,每一步都要小心翼翼,一不小心就要从头再来。一般粗略的分为材料准备,取组织消化制备细胞悬液,细胞培养三个步骤,下面我们就以取15只大鼠海马组织为例具体介绍一下:
1、材料准备
(1)新生(出生24h内)wistar大鼠15只。
(2)培养液及复合培养液成分:DMEM-F12高糖培养液,胎牛血清、Neurobasal-A,L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、阿糖胞苷、B27添加剂
(3)消化酶:木瓜蛋白酶、DNA酶、低浓度胰酶
(4)其余液体及器材:Hanks液、台盼蓝,多聚赖氨酸, CO2培养箱 倒置显微镜,荧光显微镜
2、方法
(1)预处理培养板
选用6孔塑料培养板放,加入0.1g/L左旋多聚赖氨酸1.5mL,室温包被20min,无菌PBS冲洗2遍后置于CO2培养箱待用。
(2)分离原代神经元细胞
取出生24h以内新生鼠,75%的酒精消毒,冰上断头取脑,取海马组织,置入预冷的盛有DMEM/F12和20%FBS培养液(种植液)的培养皿中。海马组织取完后吸净培养液,加入2g/L木瓜酶2ml、100ug/LDNA酶1ml(也可用3ml0.125%胰酶消化,效果也不错)消化,用1ml枪头轻轻吹打,置入37℃水浴消化20分钟(期间要不停的震荡组织悬液),然后加入等量种植液终止消化,用1ml枪头缓慢吹打后200目滤网过滤,离心机1000r/min离心,吸净上清,加入种植液3ml,用1ml枪头混匀细胞悬液用0.2%台盼蓝染色,细胞计数板计数,以1.0×105/mL的密度接种于6孔培养板中,置于37℃、5%CO2培养箱内培养。
3、细胞培养
细胞在培养箱内培养6h后将培养液全部换成 Neurobasal-A+2%B27+5μmol/L谷氨酰胺+1mmol/L丙酮酸钠的复合培养液,每隔3d全量换液。一般来说,海马神经元的形态会随着培养时间的增加不断地变化,突起会越来越多,逐渐形成神经细胞网络,再加上神经元细胞本身的光晕,状态好的细胞标本非常漂亮。如果你的细胞出现了下文中的形态特征,那么恭喜你,这表明你的细胞养的很好
海马神经元培养24h 后,大部分细胞伸出3-4个突起;培养3d后,神经元胞体增大,突起进一步增多形成稀疏网络,细胞体折光性强,光晕明显(图1);培养至第5d时,可见神经元胞体明显增大,突起增多,形态多样,交织成网状,开始形成神经细胞网络(图2);培养至第8d时,神经元分化更加成熟,胞体透亮,呈锥形或多极形,光晕明显,神经元之间的突起联系更加紧密,可见密集的神经细胞网络。培养13d后,神经元开始退化、变性,胞体萎缩,神经细胞网络开始老化。一般情况下,神经元培养7-9d即可用于实验研究。
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图1 图2
关于神经元的培养方法在某些文献中也有阐述,但是有些研友仍会失败,究其原因可能是文献中很多细节没有详细介绍,要想成功培养神经元细胞,还要注意以下几点:
(1)选择出生24h以内新生大鼠纳入实验;
(2)取海马组织的过程冰上操作,这样既能减轻神经组织的损伤,又能提高细胞活力;
(3)消化酶:有两种方案都可选择,文案中也有提及,第一种方案木瓜酶加DNA酶比较温和,但是消化不彻底,残留组织多;根据我们目前的研究,可以选用第二种方案,用低浓度胰酶消化,也无明显的细胞损伤,细胞量可以保证;
(4)消化时不建议用剪刀剪碎组织,剪碎的过程中可能进一步加重组织损伤,影响细胞量,故建议用1ml枪头缓慢吹组织悬液,吹打时间计入总消化时间;
(5)不少研友消化期间会吹打组织悬液,但我们的研究表明消化期间尽量避免吹打组织悬液较好,因为神经元细胞比较脆弱,容易损伤,吹打过度可能造成过度消化进而出现细胞死亡,造成细胞量减少
(6)最重要一点:无菌原则!细胞培养只要成功渡过感染关,就成功了一半,这要求我们的每一步操作都要注意,稍有不慎,就会前功尽弃。这也是实验成败的关键!
链接上篇 【实验趣谈】我与海马神经元的爱恨情仇之一
路漫漫其修远兮,吾将上下而求索,实验之路漫漫,希望研友们都能一次成功,一战成名!
文章|Ronan
排版|肉肉
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