我与海马神经元的爱恨情仇之二
——原代培养海马神经元
上一篇文案里已经和大家吐槽了我的原代细胞，超级超级不好养，而且超级费钱，所有的经验教训简直可以写一本血泪史，今天就和大家一起分享一下我的原代细胞培养方法，希望能让大家避免走一些不必要的弯路，共同探讨学习。
原代细胞培养步骤需要准备的东西较多，步骤也比较繁琐，从组织的选择到细胞的培养，每一步都要小心翼翼，一不小心就要从头再来。一般粗略的分为材料准备，取组织消化制备细胞悬液，细胞培养三个步骤，下面我们就以取15只大鼠海马组织为例具体介绍一下：
1、材料准备
（1）新生（出生24h内）wistar大鼠15只。
（2）培养液及复合培养液成分：DMEM-F12高糖培养液，胎牛血清、Neurobasal-A，L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、阿糖胞苷、B27添加剂
（3）消化酶：木瓜蛋白酶、DNA酶、低浓度胰酶
（4）其余液体及器材：Hanks液、台盼蓝，多聚赖氨酸， CO2培养箱 倒置显微镜，荧光显微镜
2、方法
（1）预处理培养板
选用6孔塑料培养板放，加入0.1g/L左旋多聚赖氨酸1.5mL，室温包被20min，无菌PBS冲洗2遍后置于CO2培养箱待用。
（2）分离原代神经元细胞
取出生24h以内新生鼠，75%的酒精消毒，冰上断头取脑，取海马组织，置入预冷的盛有DMEM/F12和20%FBS培养液（种植液）的培养皿中。海马组织取完后吸净培养液，加入2g/L木瓜酶2ml、100ug/LDNA酶1ml（也可用3ml0.125%胰酶消化，效果也不错）消化，用1ml枪头轻轻吹打，置入37℃水浴消化20分钟（期间要不停的震荡组织悬液），然后加入等量种植液终止消化，用1ml枪头缓慢吹打后200目滤网过滤，离心机1000r/min离心，吸净上清，加入种植液3ml，用1ml枪头混匀细胞悬液用0.2%台盼蓝染色，细胞计数板计数，以1.0×105/mL的密度接种于6孔培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱内培养。
3、细胞培养
细胞在培养箱内培养6h后将培养液全部换成 Neurobasal-A+2％B27+5μmol/L谷氨酰胺+1mmol/L丙酮酸钠的复合培养液，每隔3d全量换液。一般来说，海马神经元的形态会随着培养时间的增加不断地变化，突起会越来越多，逐渐形成神经细胞网络，再加上神经元细胞本身的光晕，状态好的细胞标本非常漂亮。如果你的细胞出现了下文中的形态特征，那么恭喜你，这表明你的细胞养的很好
海马神经元培养24h 后，大部分细胞伸出3-4个突起；培养3d后，神经元胞体增大,突起进一步增多形成稀疏网络,细胞体折光性强,光晕明显（图1）；培养至第5d时,可见神经元胞体明显增大,突起增多,形态多样,交织成网状,开始形成神经细胞网络（图2）；培养至第8d时，神经元分化更加成熟,胞体透亮，呈锥形或多极形，光晕明显，神经元之间的突起联系更加紧密,可见密集的神经细胞网络。培养13d后，神经元开始退化、变性，胞体萎缩，神经细胞网络开始老化。一般情况下，神经元培养7-9d即可用于实验研究。
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图1 图2
关于神经元的培养方法在某些文献中也有阐述，但是有些研友仍会失败，究其原因可能是文献中很多细节没有详细介绍，要想成功培养神经元细胞，还要注意以下几点：
（1）选择出生24h以内新生大鼠纳入实验；
（2）取海马组织的过程冰上操作，这样既能减轻神经组织的损伤，又能提高细胞活力；
（3）消化酶：有两种方案都可选择，文案中也有提及，第一种方案木瓜酶加DNA酶比较温和，但是消化不彻底，残留组织多；根据我们目前的研究，可以选用第二种方案，用低浓度胰酶消化，也无明显的细胞损伤，细胞量可以保证；
（4）消化时不建议用剪刀剪碎组织，剪碎的过程中可能进一步加重组织损伤，影响细胞量，故建议用1ml枪头缓慢吹组织悬液，吹打时间计入总消化时间；
（5）不少研友消化期间会吹打组织悬液，但我们的研究表明消化期间尽量避免吹打组织悬液较好，因为神经元细胞比较脆弱，容易损伤，吹打过度可能造成过度消化进而出现细胞死亡，造成细胞量减少
（6）最重要一点：无菌原则！细胞培养只要成功渡过感染关，就成功了一半，这要求我们的每一步操作都要注意，稍有不慎，就会前功尽弃。这也是实验成败的关键！
链接上篇 【实验趣谈】我与海马神经元的爱恨情仇之一
路漫漫其修远兮，吾将上下而求索，实验之路漫漫，希望研友们都能一次成功，一战成名！
文章｜Ronan
排版｜肉肉
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