肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种高死亡率的原发性肝癌。它是一种全球范围最常见的恶性肿瘤，尤其是在亚洲、非洲和南部欧洲。肝细胞癌（HCC）是肝癌的主要组织学亚型，占原发性肝癌的90%，是全世界癌症相关死亡率的第三大常见原因。
近年来，免疫检查点抑制剂，如PD-1和CTLA-4抑制剂，已被认为是对癌症患者很有前途的治疗方法。这些“检查点封锁”治疗方法旨在通过减轻其调节机制来改善肿瘤浸润性T细胞(TIL)的活性。
HCC（干细胞癌） 图片来源于网络侵删
本文章对来自肝细胞癌 (HCC) 患者手术切除的总共235个标本进行了检查，以确定肿瘤和邻近组织中耗尽的T细胞 (Tex) 的浸润。我们对从HCC患者的肿瘤组织、邻近正常组织 (ANT) 和外周血中收集的 CD3+ 细胞进行了深度单细胞靶向免疫分析。总共确定了10个具有不同分布和特征的细胞簇。
有文献表明耗竭性T细胞和调节性T细胞 (Tregs) 包括肿瘤免疫抑制微环境的不同亚群，它们在肿瘤进展中起关键作用。了解 T 细胞的亚群多样性是开发癌症免疫疗法的关键问题。
小知识：
所谓 T 细胞耗竭（T Cell Exhaustion）就是指常见慢性感染和癌症患者体内T细胞功能丧失。
由于长期暴露于持续性抗原或慢性炎症，疲惫的T细胞逐渐失去效应功能，记忆T细胞特征也开始缺失。不过这种耗竭是可以逆转的，至少部分逆转，主要是通过阻止PD-1之类的抑制性通路。T 细胞衰竭是癌症病人免疫功能障碍主要因素之一。
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实验样本：
被诊断为HCC的248例患者病理。在肿瘤切除前，所有患者均未接受化疗或放疗。采集患者的配对HCC肿瘤、ANTs或外周血。ANTs距离匹配的肿瘤组织大于或等于3cm。获得13例HCC患者的新鲜标本，用于后续的CD3+细胞分选，然后进行单细胞RNA测序分析或体外检测。
样本处理：
采用样品制备Ficoll溶液(17544202GEheacth)提取外周血单个核细胞(PBMCs)。简而言之，术前在抗凝管中采集10mL的新鲜外周血。用PBS稀释1：1稀释外周血，用Ficoll轻轻转移到离心管中。通过Ficoll梯度分离分离PBMCs，然后用1×PBS洗涤2次。
将新鲜的肿瘤和ANT标本浸泡在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基(Gibco)中，然后切割、修剪，并通过40个μm细胞过滤器。然后，将悬浮细胞以1500rpm离心10min。去除上清后，用红细胞裂解缓冲液(Solarbio)重悬细胞微球，在冰上孵育5min。细胞微球用1×PBS洗涤2次。
使用人类CD3微珠分离试剂盒(Miltenyi Biotec，130-050-101)对血液和组织中的单细胞RNA测序CD3+细胞进行测序。
通过BD Rhapsody单细胞分析系统和BD Rhapsody™免疫反应小组（人类）在单细胞水平上分析分离细胞的免疫反应。共对6267个细胞进行了测序。通过靶向扩增获得单细胞mRNA转录组最终测序的扩增系统和文库。分析过程从Read1和Read2之间配对的FASTQ文件开始，通过多步骤质量检查过滤、样本标记检索、单细胞表达谱矩阵生成、单细胞群体聚类分析，最后通过单细胞靶向测序完成。每个细胞检测到399个与T细胞功能相关的靶基因。
单个CD3+细胞转录组分析
整体研究设计方案。将单细胞RNA测序应用于来自2例患者（21号和22号）外周血(B)、肿瘤(T)和邻近正常组织(P)的T细胞。配对的瘤周组织或外周血来自同一患者。邻近的正常组织距离匹配的肿瘤组织至少有3cm。
对从肿瘤、邻近正常组织和HCC患者的外周血中分离出来的CD3+细胞进行了深部scRNA检测。
显示不同组织中不同类型T细胞的平均百分比的直方图。
鉴定了10个稳定的细胞簇，包括耗尽的T细胞、自然杀伤细胞(NKs)、伽马deltaT、Treg细胞、效应CD8+T细胞、效应CD4+T细胞、幼稚T细胞、单核细胞和树突状细胞(DCs)、粒细胞等。由于单核细胞和树突状细胞的比例，粒细胞由于CD3+珠的分类可以忽略不计，我们在进一步的分析中排除了它们。已耗尽的CD8+T细胞在肿瘤组织中占主导地位，分别占CD3+细胞的29.25%和24.58%。同时，Treg细胞在肿瘤组织中分别占CD3+细胞的27.41%和10.06%，高于ANT和血液。同时，NKT、效应CD8+或CD4+T细胞中分别主要存在于血液和瘤周组织中。
(C)基于6267个单细胞转录组的T细胞簇的T-SNE可视化。
(D)2例患者的t-SNE投影，显示细胞来源的形成。
比较了来自不同来源(血液、肿瘤周和肿瘤的细胞聚集，数据显示，患者之间的聚集程度发生了变化对于21号患者，从血液、肿瘤周或肿瘤中提取的细胞明显分离。而23号患者的边界模糊，提示HCC患者之间存在明显的异质性。
T-SNE图显示了每个聚类中的代表性标记
FACS分析细胞用CD4、CD3、CD8、PD-1、CD45RO、CD45RA、NFATC、PFR、CD16、CD56、CD127、IFN-γ与各种荧光色素染色。FACS分析在BDFACSAriaII流式细胞仪上进行，并使用FlowJov10进行分析。
t-SNE图显示了每个聚类中的四个具有代表性的标记。这些集群包括耗尽的CD8+T细胞(耗尽的CD8)、自然杀伤细胞(NK)、伽马deltaT、Treg细胞、效应CD8+T细胞、效应CD4+T细胞和幼稚T细胞。
每个聚类中的代表性标记如图所示。第一个簇是除PDCD1外的衰竭T细胞，也表达上调的衰竭标志物，如TIM3、LAG3和CTLA4(图A)。
第二个簇是自然杀伤T细胞(NKT)，高表达特征基因，如GNLY、CD16和GZMB(图B)，显示了它们的自然杀伤活性和效应功能。
第三个聚类是treg(图C)，肿瘤免疫在抑制免疫中发挥作用。它在肿瘤组织中明显高于ANT和PBMC，表达FOXP3、CD25、ICOS等。
第四个簇，细胞毒性CD8+T细胞(图D)，在肿瘤中显著降低，这可以通过CCL4、IFNG和KLRC3等基因的表达得到证实。图3E-H显示了簇(效应CD4+细胞、静止Treg、伽马deltaT细胞、幼稚T细胞)及其代表性标记物的表达。
CD8+T细胞耗尽的特征
(A)点图显示了使用BD的数据视图软件制作的基因表达频率。(B)基于CD3+CD8+CD45RO+T细胞在肿瘤周和肿瘤之间的高通量测序(ATAC-seq)数据的可访问OCRs展示。配对的肿瘤周组织和肿瘤组织来自同一患者。邻近的正常组织距离匹配的肿瘤组织至少有3cm。(C)Treg细胞是抑制CD4+T细胞的一种特系，在各种生物学环境下的免疫耐受中起着至关重要的作用。Treg细胞获得强烈增强的抑制功能。效应CD4+、静息Treg和抑制性Treg细胞转录因子表达不同的模式。(D)流式细胞术检测肿瘤和肿瘤周CD3+CD8+CD45RO+T细胞在蛋白水平上的表达。
我们观察到耗尽的CD8+T细胞的过渡分化和肿瘤组织中越来越富集的 Treg。Tex的积累和位置与HCC长期临床结果的差异有关。
此外，单细胞 RNA-seq 数据显示
(1) 细胞从效应 CD8+ T 细胞转化为耗竭的 CD8+ T 细胞同时表达 上调效应分子和抑制性受体；
(2) 表明在早期衰竭阶段与应激反应和细胞周期相关的基因表达改变；
(3) 与静息Treg相比，免疫抑制性Treg具有显着激活。
T 细胞耗竭是一个渐进的过程，基因表达谱显示的 T 细胞耗竭和无反应性是不同的。 因此，功能衰竭可能是由被动缺陷和应激反应过度激活的组合效应引起的。结果有助于了解癌症中 T 细胞功能的动态框架，这对于设计合理的癌症免疫疗法很重要。
BD RhapsodyTM单细胞测序系统介绍
BD Rhapsody 系统基于BD 在细胞生物学领域40年的专业技术，克服了传统检测的局限性，能够对成千上万个单细胞的数千个 表达基因同时进行数字定量，每个细胞提取独立数据，体现异质性，可以鉴定和表征新型和罕见细胞类型，有助于理解从免疫 学到肿瘤学等多个领域内的生物学过程。
1、BD Rhapsody 核心技术之微孔板
一个微孔 = 一个单细胞 + 一个磁珠
BD Rhapsody Express单细胞分析系统提供的单细胞分割，以微孔为基础，功能强大。
1． 最低限度一套台式设备，没有射流泵
2． 当细胞在重力作用下沉入微孔时，可以对其进行温和的处理
3． 每个BD Rhapsody微孔板均包括一个超过22万个分区的微孔阵列
4． BD Rhapsody"微孔板体积约为600μL，稀释细胞悬浮液可直接装入微孔板，无需将其浓缩到非常小的体积
5． 由于没有微流通道，因此细胞堵塞通道的问题并不严重
6． 微孔经过特殊处理，以防止细胞粘附在表面，并进行深入的质量控制
Rhapsody利用微孔进行单细胞分离，属于Microwell-seq。 20万个微孔的尺寸被设计成一个微孔恰好可以容纳一个bead+一个细胞。
2、BD Rhapsody核心技术之Barcoded Bead
3、 单细胞文库制备及测序
BD Rhapsody
Reference:Analysis of single-cell RNAseq identifies transitional states of T cells associated with hepatocellular carcinoma
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