在特异的组织或细胞群中,实际存在大量的细胞类型,且每种细胞类型拥有大相径庭的细胞谱系和功能。而由这些细胞有机构成的组织、器官和生物个体或微生物群落,才是发挥完整的生物学功能的基础。
单细胞研究(Single-cell Analysis)作为一种系统生物学研究方法,可以弥补传统方法存在的缺陷,在单细胞水平对生物信息进行解析。
流式技术:单细胞研究利器
流式细胞分析技术
流式细胞术(Flow Cytometry)是20 世纪70 年代开发出的一种依赖于流体的细胞学检测技术,简单地说就是对处在快速直线流动状态中的单细胞或其他生物微粒(如细胞核、细菌、染色体、微球等)进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。现代的流式细胞分析仪,通常由液流系统、光学系统和电子系统组成。含有微粒的样本被高速流动的鞘液包裹,并被压缩成一条液流直线,使得被检测微粒逐一通过流动检测池(Flow Cell),被激光束照射从而产生信号。流式细胞仪类似于一架显微镜,流式的光学系统相当于显微镜的“光源”,液流系统类似于显微镜的可移动“载物台”,而流式的电子细胞类似于显微镜的“目镜”。
流式细胞术产生的光信号可分为散射光信号和荧光信号。散射光信号分为前向角散射光(Forward Scatter,FSC)和侧向角散射光(Side Scatter, SSC),这两类光信号为微粒的物理参数。FSC 与被测微粒的大小有关,而侧向角散射光是指与激光束正交90° 方向的散射光信号,可提供有关细胞内颗粒性质和复杂程度的信息,根据这些散射光特性可以初步将检测微粒分类。而流式细胞仪的激光可以激发被检测微粒上的荧光基团,从而发出发射光,通过不同的通道收集可以用于被检测微粒上特定染料、探针或特异性荧光抗体,从而反映相应的生物学信息。
流式细胞术的光信号(散射光信号和荧光信号)
流式细胞术可以对符合检测尺寸大小的微粒进行检测(一般为0.2-50μm),包括培养的细胞、临床样本来源的细胞、细菌及其他微生物、细胞核或染色体、人工合成微球等。对于可以检测的参数指标,涉及结构和功能的各个方面。综上所述,结合了现代的物理激光技术和电子技术,流式的分析可以做到快速、多参数、特异性、单细胞逐一分析,并具有统计学意义。
流式细胞术用于细胞的结构和功能的分析
流式细胞分选技术
依赖于荧光激活细胞分选术(Fluorescence-activated Cell Sorting, FACS),可以有效快速地获得特定生物学属性的细胞。细胞分选一般依赖于机械捕获或者电荷偏转,而多数商业化流式细胞分选仪采用液滴加电偏转方式进行细胞获取。一般地,在流动室的喷嘴(Nozzle)上方配有一个高频压电芯片,形成高频振荡,使喷出的液流断裂为均匀的液滴,待测细胞就分散在这些液滴之中;将这些液滴充以正、负不同的电荷,当液滴经过高压电场时,发生偏转,落入各自的收集容器中,而没有充电的液滴落入中间的废液接收器,从而实现不同类型的细胞的分离。
利用流式的分选功能分选得到高纯度、高活性的细胞,可以通过直接培养、诱导、增殖、分化、活化或移植等进行更深一步的细胞功能和细胞治疗探索,也可以在此基础上逆向进行组学的相关研究,探索和寻找致病基因、致病蛋白和疾病信号传导方式等。
流式分选原理
流式单细胞分选及优势
高精度
流式分选可以依据荧光信号的强度挑出特定生物学属性的细胞,相比起其他单细胞分离技术(如有限稀释法、激光捕获显微切割、显微操作等),其特定类型的单细胞获取更具准确性。另外,依赖于精确的液滴分析模式(如BD FACSAria 系列流式分选仪采用32 等份液滴分选模式,实现液滴的精确分析),流式可以准确判断相应液滴中目标细胞的数量,因此可以准确完成单细胞的分离操作。
高通量
流式细胞分选仪具有高速分析能力,可以快速识别特定细胞,尤其对于低含量细胞的分选尤为重要。流式细胞仪的分选速度快,可以在短时间内完成多孔板的操作。另外,BD 流式细胞分选仪支持96 孔和384 孔板,对于后期分析的高通量需求具有重要意义。
多参数
流式细胞仪一般配置多个激光器或多个光电倍增管用于不同荧光信号的收集和检测,因此可以支持样本中多个参数的同时检测,这一特点适合定义复杂标记的细胞类型,可用于免疫学、神经生物学、干细胞等研究。
低成本
流式细胞分选过程通常采用电荷分选方式,除细胞分析所需试剂外,没有额外的材料损耗,相比起其他的单细胞操作方式(如基于微流控技术的单细胞操作),更简单、更廉价。
索引分选
BD 独有的索引分选(Index Sorting)模式,可追溯分选获得细胞的原初生物学属性,结合下游分子生物学研究方法,让细胞基因表型研究精确到单细胞水平。从表型(Phenotype)到基因型(Genotype)的整合分析,可以系统化阐明基因表达水平和生物学属性之间的关联性。
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