Q: 罗工，我用师兄的模板咋跑出来的图和师兄的不一样呀？
A: 这个问题需要考虑的因素很多，样本类型是否一致，染色时抗体浓度，师兄的模板建立后仪器是否维修过、是否质控在控等。
Q: 哦哦，原来如此，那我现在样本是改变了，是需要重新建立模板，但是我的样品收样时间较长，会不会以后检测结果也会出现偏差？有没什么好办法让我的图保持一致？
A: 是有的哦。首先我们一定要在样本制备上是一致稳定的，详细内容可参考【罗工流式秘籍13】，特别要提醒：多色一定要做细胞计数、抗体滴定，过多的抗体，又没有充分的洗涤，会增加背景信号，即使同一天检测，样本偏差也会特别大。然后建立合适的各通道电压，即模板。怎么长期保证结果的一致性呢？在模板的电压条件下采集质控小球的数据，圈出最弱信号小球和最强信号小球，记录统计表中MFI值，长期保留画门。以后实验都先跑质控小球，对比首次数据，调整电压使MFI值与首次的值相等。
Q: 罗工，这有点难，有仪器帮助我们快速实现吗？
A: 可以选择BD 带Diva软件的流式仪如Canto、Fortessa、Celesta等，可以通过CS&T质控和Application Settings的功能自动帮我们校准。其他机型的仪器，目前没有此功能，需要手动，但也不需要担心，如果我们的仪器是质控在控的状态，微小的差异都是在流式统计可控的范围，对于不分析MFI值的差异，只统计%的差异的实验，只要仪器在控即可，不需要每天校准电压。
3个时间点，11个平台，各通道达到预期MFI的电压值变化
Q: 罗工，可是我发现我不同组的样本差异也很大诶。
A: 不同刺激或固定破膜等处理的样本，可以取blank管建立不同的电压设置，以各组blank在各个通道的MFI值相同为标准。
Q: 罗工，那不同流式仪上是否也可以做出相似的流式图？
A: 对的，但不同流式仪的拟合信号值范围有所区别，需要转换，可以以一台仪器为标准转换到另一台仪器上，但不同仪器的分辨率、溢漏情况不同，多平台测试低表达群体的统计影响是较大的。
引用：
Multi-center harmonization of flow cytometers in the context of the European “PRECISESADS” project，Autoimmunity Reviews 15 (2016) 1038–1045.
Using BD FACSDiva CS&T to evaluate cytometer performance，create custom assay settings and implement cross-instrument and cross-site standardization of assays.
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