Q: 罗工,我用师兄的模板咋跑出来的图和师兄的不一样呀?
A: 这个问题需要考虑的因素很多,样本类型是否一致,染色时抗体浓度,师兄的模板建立后仪器是否维修过、是否质控在控等。
Q: 哦哦,原来如此,那我现在样本是改变了,是需要重新建立模板,但是我的样品收样时间较长,会不会以后检测结果也会出现偏差?有没什么好办法让我的图保持一致?
A: 是有的哦。首先我们一定要在样本制备上是一致稳定的,详细内容可参考【罗工流式秘籍13】,特别要提醒:多色一定要做细胞计数、抗体滴定,过多的抗体,又没有充分的洗涤,会增加背景信号,即使同一天检测,样本偏差也会特别大。然后建立合适的各通道电压,即模板。怎么长期保证结果的一致性呢?在模板的电压条件下采集质控小球的数据,圈出最弱信号小球和最强信号小球,记录统计表中MFI值,长期保留画门。以后实验都先跑质控小球,对比首次数据,调整电压使MFI值与首次的值相等。
Q: 罗工,这有点难,有仪器帮助我们快速实现吗?
A: 可以选择BD 带Diva软件的流式仪如Canto、Fortessa、Celesta等,可以通过CS&T质控和Application Settings的功能自动帮我们校准。其他机型的仪器,目前没有此功能,需要手动,但也不需要担心,如果我们的仪器是质控在控的状态,微小的差异都是在流式统计可控的范围,对于不分析MFI值的差异,只统计%的差异的实验,只要仪器在控即可,不需要每天校准电压。
3个时间点,11个平台,各通道达到预期MFI的电压值变化
Q: 罗工,可是我发现我不同组的样本差异也很大诶。
A: 不同刺激或固定破膜等处理的样本,可以取blank管建立不同的电压设置,以各组blank在各个通道的MFI值相同为标准。
Q: 罗工,那不同流式仪上是否也可以做出相似的流式图?
A: 对的,但不同流式仪的拟合信号值范围有所区别,需要转换,可以以一台仪器为标准转换到另一台仪器上,但不同仪器的分辨率、溢漏情况不同,多平台测试低表达群体的统计影响是较大的。
引用:
Multi-center harmonization of flow cytometers in the context of the European “PRECISESADS” project,Autoimmunity Reviews 15 (2016) 1038–1045.
Using BD FACSDiva CS&T to evaluate cytometer performance,create custom assay settings and implement cross-instrument and cross-site standardization of assays.
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