1、常用的His标签蛋白纯化填料，Ni Sepharose 6FF和Ni Sepharose HP有什么区别，应该如何选？
答：HP：High Performance，高性能，填料平均颗粒大小约34 μm，颗粒细能带来高分辨率的分离纯化。HP 纯化后峰更窄，样品浓度高，节省了浓缩步骤的时间，但会带来更高的反压，因此流速更慢。FF：Fast Flow，快流速，填料平均颗粒大小约 90 μm，较 HP 颗粒粗，流速快，具有良好的分辨率及轻松实现规模扩大的分离纯化，同样适用于重力流下的蛋白纯化和多孔板筛选。
2、HisTrap FF Crude 和 HisTrap excel 的特点是什么？应该如何选择？
答：HisTrap FF Crude 的滤膜孔径更大，裂解液无需离心过滤处理，可以直接上样，适合样品不稳定或者比较粘稠容易造成柱子堵塞的料液。例如如果纯化包涵体蛋白较多时，可以优先考虑FF Crude （预装柱）或 FF。
HisTrap excel 最大的特点是镍脱落极低，且能耐受 100 mM EDTA，特别适合真核外泌蛋白（如培养基中含有螯合剂）。无需脱镍，即可直接使用 NaOH 清洗，防止交叉污染且有更长的使用寿命。
3、 His 标签蛋白纯化实验中，常用的缓冲液成分是什么？
答：建议缓冲溶液成分如下
· 结合缓冲溶液：
FF、 HP系列： 20mM磷酸钠缓冲溶液， 500mM NaCl(避免非特异电荷吸附)， 20-50mM 咪唑(提高浓度，可以增加纯度但会降低收率)， pH7.4 (可以根据实际情况调节pH)。
Talon 系列： 20mM 磷酸钠缓冲溶液， 500mM NaCl， 10-20mM咪唑， pH7.4。
Excel 系列： 20mM 磷酸钠缓冲溶液， 500mM NaCl， pH7.4 (结合缓冲液中一般不添加咪唑，在wash缓冲液中可根据样品性质加入 0-30 mM 咪唑)
· 洗脱缓冲溶液：
20mM 磷酸钠缓冲溶液， 500mM NaCl， 500mM 咪唑， pH 7.4
4、纯化得到的组分中没有或很少目的 His 标签蛋白，怎么回事？
答：若目的 His 标签蛋白正常表达（使用抗 His 标签的抗体进行WB 检测）且充分释放至上清中，确认蛋白是流穿还是未被洗脱 ：
若 His 标签蛋白流穿 ：
· 样品或结合缓冲液的条件不合适，注意螯合剂或强还原剂以及咪唑的浓度。
· His 标签蛋白与填料的结合较弱 ：降低上样流速或增加孵育时间 ；增加标签 His 的数量（常用 6 – 10 个） 。
· His 标签未充分暴露 ：在变性条件（ 4 – 8 M 尿素或 4 – 6 M 盐酸胍） 下进行纯化或测试 ；重新构建克隆，改变 His 标签的位置。
· 尝试其他的金属离子 ：如 Zn2+、Cu2+、Co2+ 等。
若 His 标签蛋白未洗脱 ：
· 洗脱条件过于温和 ：增加咪唑浓度或降低洗脱 pH（注意 ： pH降至 4.0 以下时 Ni2+ 会发生脱落）。
· 目的蛋白与填料发生非特异性疏水或其他相互作用 ：在洗脱缓冲液中加入非离子型去垢剂（如 2% Triton X-100）或提高 NaCl浓度。
· 目的蛋白在填料中发生了沉淀 ：减少上样量 ；使用咪唑线性梯度而不是步级洗脱以降低洗脱得到的蛋白浓度 ；使用去垢剂或改变 NaCl 浓度 ；在变性条件 (4 – 8 M 尿素或 4 – 6 M 盐酸胍 )下洗脱。
5、洗脱得到的 His 标签蛋白样品的杂带较多，纯度不高，应该如何改进？
答：可以考虑以下可能原因与解决方法 ：
· His 标签蛋白被部分降解 ：添加蛋白酶抑制剂 ( 慎用 EDTA) ；保持蛋白样品在低温下操作 ；缩短实验操作的时间，例如使用crude 系列预装柱省略离心澄清的步骤。
· 杂蛋白对于金属离子也有较强的结合 ：优化结合、洗脱条件 ( 咪唑浓度、 NaCl 浓度、 pH 条件等 ) ；尝试不同金属离子螯合的填料 ( 例如 Co2+ ： HiTrap TALON crude 预装柱和 TALON Superflow 填料 ) ；增加后续的纯化步骤，例如离子交换、凝胶过滤等 ；构建双标签目的蛋白进一步纯化。
· 杂质与目的蛋白存在相互作用而共洗脱 ：在细胞破碎前加入去垢剂或还原剂 ；提高 Wash buffer 中去垢剂浓度 (2% Triton X-100 或 2% Tween 20) 或添加甘油 (20% 以内 ) 以破坏非特异性相互作用 ；将缓冲液的盐浓度提高至 500 mM NaCl。
· 洗杂步骤不够充分 ：重复洗杂的步骤使洗杂充分。
6、使用 HisTrap 柱纯化包涵体时，柱上复性 (On-column refolding) 的主要步骤是什么？
答：使用 HisTrap 柱进行柱上复性时， His 标签与金属离子的紧密结合并不会受到变性剂 ( 尿素或盐酸胍 ) 浓度的显著影响，因此在降低变性剂浓度复性的过程中， His 标签蛋白将保持结合。这种结合在除去变性剂时有利于防止聚集体的形成。柱上复性的另一个优点是 ：只要在层析介质的结合能力范围内，样品体积没有明显的限制。一般步骤为 ：平衡 ( 含有变性剂的平衡缓冲液 )- 上样 - 复性 ( 尿素梯度 )- 洗脱 ( 咪唑梯度 )。
7、使用几次以后发现镍柱的载量下降，蛋白结合效率降低，应该如何处理？ HisTrap 或 Ni 填料怎么进行有效的再生或清洗？普通 Ni 柱是否可以在不脱镍的情况下进行清洗？
答：如果镍柱的载量下降或者挂柱效率降低，可能是由于逐渐积累的沉淀、变性或非特异结合的蛋白占据了有效的结合位点，而通过洗脱液无法彻底清洗所致。建议可以采用不同的清洗方法来提高载量。
(1) 由于 NaOH 清洁效果最佳，一般建议按照说明书中的操作方法先脱镍再进行清洁。
首先用 5－ 10 倍柱体积的脱镍缓冲液 ( 20 mM 磷酸钠， 0.5 M NaCl，50 mM EDTA， pH 7.4 ) 洗涤，进行脱镍操作，然后用 5－ 10 倍柱体积的平衡缓冲液冲洗，最后用 5－ 10 倍柱体积的双蒸水冲洗 ；随后进行清洗操作 ：
· 去除离子型杂蛋白，可以用 5 倍柱体积的 1.5 M NaCl 溶液，然后 10 倍柱体积的双蒸水冲洗。
· 去除沉淀或变性蛋白，可以用 1 M 氢氧化钠溶液，接触 1－ 2小时，然后用 10 倍柱体积的平衡缓冲液和 10 倍柱体积的双蒸水进行冲洗。
· 去除疏水蛋白或者脂蛋白，可以用 5－ 10 倍柱体积的 30% 异丙醇溶液清洗，然后 10 倍柱体积的双蒸水洗涤。
最后进行再生镍操作，用 0.1 M 硫酸镍上柱 ( 至少 0.5 倍柱体积 )，随后 5 倍柱体积的双蒸水和平衡缓冲液进行洗涤，如需保存，保存在 20% 乙醇溶液即可。一般经过 5 – 7 次纯化之后可以进行脱镍、清洁和再生镍的操作。普通 Ni 柱（例如 Ni Sepharose FF 或 HP）不建议在不脱镍的情况下进行 NaOH 清洗，避免游离镍离子产生氢氧化物沉淀。
(2) 如果只需要温和清洁，可以不脱镍 ：
· 去除沉淀或变性物质，可以尝试用 2 倍柱体积的 6M 盐酸胍或8M 尿素洗涤，然后用 5 倍柱体积的缓冲液洗涤。
· 去除疏水结合的物质，可以尝试 2 倍柱体积 1% Triton X-100 洗涤，然后用 5 倍柱体积的缓冲液洗涤。
8、镍柱不小心在没有脱镍的情况下用 NaOH 进行了清洗，如何处理？
答：柱子中存在的很少量游离的 Ni2+，会在高 pH 条件下，形成Ni(OH)2 沉淀。使用水或缓冲液冲洗后，可以视情况补充镍并继续使用。为了避免金属盐的沉淀，应尽量避免这种操作。
9、镍柱使用中出现棕色是怎么回事？
答：主要是缓冲液中 DTT 的影响，在碱性的缓冲液条件下，镍离子会被 DTT 还原生成棕色的沉淀。
如果样品或缓冲液中含有 DTT，在上样之前，建议采用不含还原性试剂的空白运行来除去任何较弱结合的镍离子 ；当不使用时，勿将 Ni Sepharose 填料保存于含还原性试剂的缓冲液中。
空白运行方法 ( 使用不含还原剂的平衡液和洗脱液 ) ：
1) 5 倍柱体积的双蒸水洗柱 ；
2) 5 倍柱体积的洗脱液洗柱 ；
3) 10 倍柱体积的平衡液平衡。
10、普通的 Ni 填料是否可以重复使用？可以使用多少次 ?
答：使用次数应视使用情况而定。如果维护的好的话，寿命会延长。如果每次都是纯化同样的蛋白，没有必要剥离掉镍离子重新挂镍，一般经过 5 – 7 次纯化之后可以进行脱镍和再生镍的再生操作。
如果柱子反压高了，填料需要做彻底的在位清洗 CIP，在清洗之前，为了避免金属盐的沉淀，需要剥离掉镍离子，清洗后再重新挂镍，最后保存在 20% 的乙醇中。
11、 HisTrap 柱子堵了应该如何处理？
答：柱子发生堵塞，可能是样品中细胞碎片或其他杂质颗粒所致，所以样品一定要离心，或者用 0.22/0.45 μm 的滤膜过滤。由于 E.coli 裂解液比较难过滤，如果只用 10000 g 的转速离心后直接上柱，对填料损害较大，很容易堵塞柱子。针对这种情况，HisTrap FF Crude 系列预装柱可以允许初处理的裂解液直接上样，减少了操作时间。对于更大规模的样品，可以考虑中空纤维滤柱0.1 – 0.2 μm 孔径进行澄清，否则柱子会因为经常堵塞而报废。
如果柱子发生了堵塞，请及时做在位清洗，若不成功，则需要更换填料或者柱子，并在下次上样时优化样品的处理方法。
对于预装柱或者是填料，请做好日常的清洗和维护，具体方法请参考说明书。若柱子反压增高了，请进行彻底的在位清洗 CIP。
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