生物药物杂质可以分为外来污染物和与产品相关杂质两大类,其中外来污染物包括微生物污染、热原、细胞成分、培养基中的成分、来自生产过程中各步骤的物质以及来自纯化步骤的物质等等。各种杂质和数量会影响最终药品的安全性,在其开发过程中对杂质的鉴别、定量、定性和控制以及去除是非常重要的。
今天小编总结了部分相关杂质检测,涉及抗体药研发,细胞治疗和mRNA疫苗等研究领域,敲黑板,做笔记喽...
①双链RNA(dsRNA)残留检测;
②宿主DNA残留检测;
③Protein A 检测;
④BSA残留检测;
⑤CHO宿主蛋白(HCP)残留检测;
⑥E.coli大肠杆菌宿主蛋白(HCP)残留检测
dsRNA残留
在基于酶反应制备mRNA疫苗的过程中,异常的体外转录反应(In vitro transcribed ,IVT)也可能会引入dsRNA污染物。相较于病毒来源的dsRNA,体外反应中生成的dsRNA污染的检测和去除对于RNA疫苗更为重要。混入了dsRNA污染的IVT mRNA会引起强烈的I型干扰素介导的抗病毒反应,上调PKR和OAS等关键酶的表达,导致细胞翻译水平的抑制和细胞内mRNA和核糖体RNA的降解。相应的,引入能高效去除dsRNA污染的FPLC纯化过程,能在原代人DC细胞中1000倍提升IVT mRNA介导的蛋白表达。因此,mRNA疫苗生产过程中合适、有效的IVT mRNA纯化对于DC细胞抗原蛋白的最大化生产非常关键,并能避免不必要的自身免疫反应的激活。
均相时间分辨荧光(TR-FRET)技术使用双抗夹心法检测dsRNA,是替代ELISA和qPCR的一种快速,高灵敏的检测方法。实验全程无洗涤,实现均相二步法检测。该技术凝聚了时间分辨(TRF)和荧光共振能量转移(FRET)两大技术核心,实现检测背景低,高通量,高特异性,高灵敏度,除技术优势外,还具有超高性价比,现已受到国际和国内众多mRNA研究客户认可。
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宿主细胞DNA残留
生物制品中的重组蛋白药、抗体药、疫苗等产品是用连续传代的动物细胞株表达生产,虽然经过严格的纯化工艺,但产品中仍有可能残余宿主细胞DNA。病毒性疫苗中宿主细胞残留DNA相关的风险主要是感染性和致癌性,如果存在逆转录病毒前病毒,其基因整合入受者基因组可能导致感染;如果存在病毒或传代细胞基质中的致癌基因,则可能具有引发肿瘤的潜在风险。因此,建立合适的宿主细胞残留DNA的检测方法对监测生物制品的安全性和质量可控性至关重要。
LANCE技术用于分析检测和定量缓冲溶液和细胞培养基中的DNA污染物,利用镧系元素Eu和APC ULight分别作为荧光能量供体和受体,实现荧光定量检测。该技术全程无需洗涤和包被,实验背景低,检测下限54.5 pg/mL,检测范围:54.5– 30,000 pg/mL。EC50: 50.1 ng/mL。
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大肠杆菌宿主蛋白残留
大肠杆菌是应用最广泛,最成功的表达体系,因此大肠杆菌常被用于重组蛋白生产、基因治疗、细胞治疗以及近几年非常火热的mRNA疫苗生产等。中国药典各论中,E.coli菌体HCP应不高于蛋白质总量的0.10% 。大肠杆菌发酵过程中产生的HCP受到菌株背景、细胞培养条件和重组药物等因素影响,目前没有一个通用试剂盒能够覆盖到到每个HCP检测。
Biogenes大肠杆菌360-HCP ELISA通过不同的抗HCP抗体提供更高特异性和灵敏度,分为四种试剂盒类型(A型,C型,D型,E型),用于优化HCP检测。区别为大肠杆菌抗原遗传背景:BL21(DE3)和W3110和培养基:LB培养基和矿物培养基。
由于难以预测大肠杆菌中的HCP谱,我们建议首先测试所有四种试剂盒类型,然后根据ELISA关键参数(如稀释线性,准确性和覆盖率)选择性能最佳的试剂盒。
TypeCell lineGrowth Mediu
Type A 2GBL21 (DE3)Mineral Medium
Type EW3110Mineral Medium
Type D 2GBL21 (DE3)LB Medium
Type CW3110LB Medium
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