当使用与样本种属来源一致的一抗时，会发生非特异性背景染色。如免疫组化实验中一抗和样本的种属来源都是小鼠(M.O.M. staining)就是这个问题的一个常见例子。这篇文章为大家解答如何在这类实验中防止非特异性背景信号的产生。
非特异性背景产生的原因
当使用与样本种属来源一致的一抗进行免疫染色实验的时候，组织中的内源性免疫球蛋白会被二抗识别，而二抗无法区分一抗和同种内源性免疫球蛋白。因此会产生非特异性染色，并可掩盖来自一抗的正确信号。
解决办法
单价Fab片段可用于“屏蔽”或阻断内源性Ig表位，使其无法被标记的二抗检测。Fab片段只有一个抗原结合位点，因此它们不会捕获后续步骤中使用的主抗体。相反，整个分子IgG和F(ab’)2片段是二价的(它们有两个结合位点)，对阻断内源性Ig无效。在与内源性Ig结合后，二价抗体可能有一个开放的结合位点，会捕获在后续步骤重引入的一抗。
图1. 抗体分子的分解(大约MW = 160 kDa)会产生许多不同的片段。木瓜蛋白酶消化产生两个单价Fab片段和一个Fc片段，每个约50 kDa。胃蛋白酶消化降解Fc结构域，留下一个二价F(ab’)2片段，分子量约为110 kDa。
选择与标记的二抗同宿主的Fab片段，如Fab fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)，阻断与标记的Goat Anti-Mouse IgG相结合。物种来源保持一致以确保Fab片段和标记的二抗之间没有反应。此外，在同一物种中培养的Fab片段将识别并因此阻断标记的次生分子识别的相同表位。不同的宿主动物可能会识别内源性Ig上不同的表位，阻断可能是不完全的。
更多相关Fab片段二抗产品：
货号产品名规格
315-007-003AffiniPure Fab Fragment Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)1mg
阻断细胞或组织切片上的内源性免疫球蛋白
· 将与一抗孵育后的样本用5%的来自相同种类的正常血清进行阻断。
· 继续用与样本种属来源相同的无偶联的Fab片段二抗(20-40μg/ml)进行孵育
· 接下来的步骤按照常规使用的protocol进行
阴性对照:通过去除实验中的一抗，与标记的二抗孵育，可确认阻断剂的阻断效率。确认内源性信号确实被阻断剂抑制后，继续进行常规实验。
当样本的内源性IgG处于高水平时，可能需要将Fab抗体的浓度增加到100µg/ml。为了避免Fab抗体被标记的二抗取代，如果不影响目标蛋白的抗原性，可能需要用戊二醛进行轻微的后固定。
在Western blotting或ELISA应用中，Fab抗体对阻断免疫球蛋白并不有效。
样本物种来源一抗物种来源可考虑使用的二抗货号
小鼠大鼠Donkey Anti-Rat IgG (H+L) (Min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hu, Ms, Rb, Shp Sr Prot♱)
112-005-167大鼠小鼠Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (Min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot♱)
115-005-166大鼠亚美尼亚的仓鼠Goat Anti-Hamster (Armenian Hamster) IgG (H+L) (Min X Bov, Hu, Ms, Rb and Rat Sr Prot*)
127-005-160Min X：指经过吸附处理的二抗，可以最大程度的减少物种之间的交叉反应
♱在考虑使用经过吸附处理的抗体时应谨慎，因为这些抗体大大降低了表位识别能力，可能对一些单克隆抗体的识别能力较差。
*Anti-Hamster IgG (H+L) (min X Bov, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)可能不能识别所有亚美尼亚仓鼠单克隆抗体，因为它已经过近亲物种的吸附处理(粗体部分)。因此，最好使用对较少种类吸附的抗体，如抗亚美尼亚仓鼠IgG (H+L) (min X Bov Sr Prot)，除非在需要在小鼠和/或大鼠免疫球蛋白存在的情况下检测亚美尼亚仓鼠单克隆抗体。
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