循环肿瘤DNA（ctDNA）分析已成为一种重要的临床有用的癌症诊断和治疗监测工具。然而，ctDNA检测由于DNA浓度低，所以在技术上难度大且实验情况复杂。这篇文章中，科学家们描述了其在Ion Torrent 测序平台上新开发的一种高灵敏度的ctDNA检测方法，被称之为基于杂交和标签技术的错误校正测序（HYTEC-seq）。该方法结合了杂交捕获和分子标签，以及新型variant caller PlasmaMutationDetector2以消除背景错误。科研家阐述了使用已知突变的对照样本用HYTEC-seq检测未知突变时，分析灵敏度高。此外，为了证明这种方法在临床中的实用性，科学家分析了44例晚期胰腺癌患者的血浆样本，发现57%的患者存在突变，等位基因频率低至0.23%。文章发表在NATURE scientific report期刊。
图 1 （A）HYTEC-seq实验流程 （B）原始测序reads、单链一致序列（SSCSs）和HYTEC-seq测序的每个目标位置的测序错误（替换）的相对百分比 （C）三种方法的总体错误率
实验方法
· 样本制备和cfDNA提取
整个实验中，科学家选取了四个细胞系和60个健康人的样本，也检测了44个病人的血浆样本。实验采用50ng Multiplex I cfDNA Reference Standard Set（Horizon）作为标准品验证HYTEC seq的可靠性。将患者和对照组的外周血收集到EDTA管中，并进行淋巴细胞梯度离心，将血浆在17000×g下离心10 min，去除细胞残余和剩余血小板。采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen)从血浆中提取cfDNA。提取后的cfDNA储存在-80℃待用。
· HYTEC seq 文库设计和构建
该文库使用Y型接头适用于Ion Torrent测序平台，带有Ion Torrent 平台的A和P1接头序列，样本条形码序列，和用于错误纠正的分子标签。具体操作如下:
· 将20µL两种新型的100µM P1和A接头寡核苷酸序列在50µL的反应体积中分别退火
· 使用PCR仪将接头寡核苷酸体系加热到97.5°C，持续150s
· 关闭仪器，等待1小时让接头复性
· 将复性后的接头根据cfDNA加入量用dd水稀释待用
样本DNA采取酶打断法至160pb的片段，并使用磁珠进行富集。片段长度由安捷伦2100生物分析仪进行质控（High Sensitivity DNA kit）。文库制备采用建库试剂盒搭配安捷伦的靶向捕获系统，采用了胰腺癌中常见突变的8个基因的靶向捕获panel。捕获到的DNA经PCR扩增后由磁珠富集。最终文库由安捷伦2100生物分析仪质控。
在这篇测序方法开发的研究中，安捷伦2100生物分析仪又一次展现了其在核酸质控领域的强势地位。科研家们使用的2100生物分析仪主要原理芯片式毛细管电泳结合微流控技术，操作简单，检测灵敏度高。在本次研究中老师选择的High Sensitivity DNA kit，拥有极高的 DNA 分析灵敏度，适用于低至 5 pg/µL 的片段分析，或低至 100 pg/µL 的 NGS 文库等复杂 DNA 样品分析。
联系客服
