葡萄糖介导的胰岛素传递载体--长效降糖药HmA

*仅供医学专业人士阅读参考

糖尿病已被列为危害人类健康的三大主要疾病之一。根据血糖（LBG）水平准确注射胰岛素（Ins）是标准的方法，特别是通过单次注射来长期控制LBG。

为此，中国科学院大学昝兴杰课题组设计由酶（GOx和CAT）和Ins（HmA@GCI）封装的pH响应性六组氨酸金属组装体（HmA）作为葡萄糖介导的胰岛素传递的载体。HmA不仅具有较高的蛋白加载效率，而且还能很好地保留蛋白质活性，保护蛋白质免受蛋白酶损伤。HmA、酶的生物催化活性和GOx与CAT之间的级联反应效率提高，导致对LBG变化的超反应与胰岛素释放和有效清除GOx（H2O2）的有害副产物。在糖尿病小鼠的治疗中，HmA@GCI在半小时内将LBG降低到正常水平，并通过单次皮下注射维持5天以上，连续4次注射维持近24天。在试验期间，没有观察到低血糖症状和对组织和器官的毒性。提示HmA@GCI是一种安全的长效降糖药，具有潜在的临床应用前景。

相关研究成果以“pH-Responsive Hexa-Histidine Metal Assembly (HmA) with Enhanced Biocatalytic Cascades as the Vehicle for Glucose-Mediated Long-Acting Insulin Delivery”为题于2023年6月2日发表在《Advanced Science》上。

示意图 a)将GOx、CAT和Ins共封装到HmA中，b)对葡萄糖的快速反应和葡萄糖在体内Ins的延长释放用于T1D治疗

本研究提出了一个葡萄糖响应的Ins传递系统，通过将GOx、CAT和Ins共封装到HmA中（HmA@GCI）（示意图a），显示了较高的封装蛋白（GOx、CAT和Ins）的有效载荷，并增强了GOx和CAT的生物催化活性。当将HmA@GCI注射到T1D小鼠皮下时，葡萄糖被催化成葡萄糖酸和H2O2，同时有毒的副产物H2O2被CAT催化为氧和水（示意图b）。

图1 纳米粒子的表征

采用动态光散射法测定了合成的纳米颗粒、HmA、HmA@Ins和HmA@GCI的尺寸分布和zeta电位，结果表明三种纳米颗粒的尺寸均为纳米级，尺寸分布较窄（图1a）。透射电镜分析显示，所有纳米颗粒的形状都不规则，尺寸小于动态光散射测量的形状（图1b）。进一步分析表明，HmA@GCI中Ins、GOx和CAT的诱捕效率（EE%）分别为90.43%、83.08%和83.1%（图1c）。

图2 HmA@GCI的葡萄糖反应性

HmA@GCI的pH表现出显著的葡萄糖浓度和孵育时间依赖性（图2a）。以4mg mL−1葡萄糖溶液中的HmA@GCI为例，Tyndall效应逐渐减弱，最终消失（图2b），这表明了纳米颗粒的解体。在HmA@GCI的粒径分布中观察到多个峰（图2c），这可能归因于一种解体和聚集机制。如图2d所示，F-Ins的释放与pH的变化趋势一致。在不同浓度的葡萄糖条件下，HmA@Ins释放的F-Ins没有显著差异（图2e）。如图2f所示，所得到的F-Ins释放曲线表现出脉动行为，表明胰岛素释放随着葡萄糖浓度的升高而增加，而随着葡萄糖水平的降低而减少。

图3 从纳米颗粒中体外释放Ins

如图3a-c所示，与游离蛋白相比，HmA@Ins、HmA@GOx、HmA@CAT和HmA@GC不受蛋白酶K的影响，显示酶活性显著降低。将GOx和CAT共封装成HmA纳米颗粒（HmA@GC）。如图3d所示，在好氧环境下，GOx催化葡萄糖转化为葡萄糖酸和H2O2，CAT催化H2O2生成水和O2。在10 min范围内，游离GC和HmA@GCI之间的H2O含量没有显著性差异（图3e）。以上结果表明，HmA封装后，GOx和CAT的级联反应效率得到了提高，为在体内快速清除H2O2奠定了基础。

图4 纳米颗粒的体外生物相容性

如图4a、b所示，溶血试验显示，与阳性对照（水）相比，即使在高颗粒浓度下也没有引起任何显著的溶血（低于5%）。当HmA与树突状细胞（DCs）和NIH3T3细胞孵育24小时时，HmA对树突状细胞没有细胞毒性，但在浓度高于80 μg mL−1时，对NIH3T3细胞表现出轻微的细胞毒性（图4c、d）。这些结果表明，这些纳米颗粒具有良好的生物相容性，适合用于后续的体内实验研究。

图5 T1D小鼠HmA@GCI的体内保留和抗糖尿病研究

为了评估Ins在体内的保留情况，将F-Ins和HmA@GCI皮下注射到STZ诱导的T1D小鼠中，并在MOIS下进行成像（图5a）。游离F-Ins的总荧光在2天内从100%下降到约15%，3天后进一步下降到0%（图5b）。虽然游离的Ins具有快速的降血糖作用，但在2小时内也有诱发低血糖的高风险（图5c）。注射HmA@GCI也可以在半小时内迅速将LBG降至正常水平，并维持了近5天（图5d）。在所需的时间点监测LBG，在此基础上计算出低血糖指数（图5e、f）。此外，还进行了糖耐量实验，探讨不同胰岛素制剂在体内的动态变化。如图5g所示，小鼠在15 min内血糖迅速升高至300mg dL−1以上。曲线下面积（AUC）（图5h）显示，注射HmA@GCI的小鼠对腹腔内葡萄糖耐量试验（IPGTT）的敏感性增加，与健康小鼠相似。为了证实HmA@GCI诱导的稳定、安全的降糖作用，通过反复注射HmA@GCI至糖尿病小鼠4次。如图5i所示，单次注射可维持正常的血糖状态约5天。因此，HmA@GCI作为一种胰岛素储存库和葡萄糖反应性释放介质，为糖尿病的长期治疗提供了一种新的策略。

图6 体内生物安全评估

如图6a所示，注射HmA@GI的小鼠皮肤在第一天出现明显的皮肤溃疡，而注射HmA@GCI的小鼠皮肤保持完整。从皮肤组织切片（图6b）可知，HmA@GI组可见明显的皮肤缺损，而对照组和HmA@GCI组未见明显的皮肤缺损。注射HmA@GCI的小鼠的平均体重在24天内呈上升趋势，与健康小鼠一致（图6c），而注射HmA@GCI的小鼠的饮水量明显减少（图6d）。采用细胞仪综合分析全血相关指标。如图6e-g所示，小鼠间无显著性差异，各值均在正常范围内。与对照组相比，HmA@GCI处理的小鼠AST水平较低，说明反复注射HmA@GCI后没有明显的肝损伤（图6h）。通过测量肾功能的标志物尿素氮（BUN）的水平（图6i），以评估Hm@GCI对肾脏的影响。与对照组相比，NS组糖尿病小鼠的BUN水平明显升高，而HmA@GCI组仍保持在较低水平。这说明HmA@GCI对肾功能有良好的保护作用，这主要是由于应用HmA@GCI能良好地维持血糖。HmA@GCI组的IL-1β和TNF-α水平与健康小鼠相当，说明HmA@GCI不会引起明显的免疫排斥反应（图6j、k）。此外，在第24天，任何小鼠的任何器官均未发现明显的病理变化（图6l）。以上结果表明，对组织器官无明显毒性，说明HmA@GCI是一种安全、持久的降糖制剂，具有良好的临床应用前景。

总之，本研究开发了一种pH响应的六组氨酸金属组装（HmA），该组装具有增强的生物催化级联，葡萄糖响应Ins传递，GOx、CAT和Ins在温和条件下有效地原位封装。除了保护被包裹的蛋白免受HmA内的蛋白酶的损伤外，封装酶（GOx和CAT）的生物催化活性以及GOx和CAT之间的级联反应得到增强，这导致了对LBG变化的快速反应，伴随着胰岛素的释放和GOx（H2O2）有效清除有害的副产品。HmA@GCI将糖尿病小鼠的LBG在半小时内降低至正常水平，并通过单次皮下注射维持5天以上，连续4次注射保持近24天。此外，在试验期间未观察到低血糖，对组织器官无毒性，提示HmA@GCI是一种安全、具有良好临床潜力的长效降糖药。