当水产养殖水环境恶化或温度升高时，虾容易受到病毒或细菌感染，导致大量死亡。
今天，我们分享这项研究，是通过非特异性免疫参数检测，肠道形态观察以及通过16S rRNA评估微生物菌群多样性，全面评估了南美白对虾被弧菌感染后，口服壳聚糖化合物（CS-GT）的效果。
结果表明，服用CS-GT可显着增加虾的总血细胞计数并减少血细胞凋亡（p<0.05），各项参数（包括超氧化物歧化酶，谷胱甘肽过氧化物酶，谷胱甘肽，溶菌酶，酸性磷酸酶，碱性磷酸酶和酚氧化酶）均显着提高（p <0.05）。
同时，服用CS-GT之后，肠道上皮细胞和膜的完整性得到增强，从而减轻了肠道损伤。就微生物组而言，水和肠道中弧菌（革兰氏阴性细菌和食源性病原体）的丰度显着降低。典范对应分析（CCA）表明，在水中和肠道中的弧菌丰度，在服用CS-GT之后均呈负增长。
总之，服用CS-GT可以提高虾对病原菌的免疫力，并显着降低水产养殖用水，以及南美白对虾肠道中弧菌的相对丰度。
一、南美白对虾的前生往事
虾类养殖是世界上最重要的产业之一，其中南美白对虾（Litopenaeus vannamei）由于产量高，生长快，适应性强，已成为虾类养殖中最赚钱的品种之一，全球年产量超过410万吨。南美白对虾属于温带和热带虾，它可以在10–40°C的温度下生存，最合适的温度范围是25–32°C，它可以在28-34‰的盐度范围内生长。
与其他虾类一样，南美白对虾缺乏适应性免疫机制，只能依赖先天免疫反应来检测和消除病原体。然而，由于水产养殖的环境恶化，近年来已损失约170万吨虾。其中，弧菌（包括副溶血性弧菌，哈氏弧菌和溶藻弧菌）不仅引起虾类疾病，还会给人类带来爆发胃肠炎疾病的风险。
当水产养殖水环境恶化或温度升高时（尤其是在夏季），弧菌爆发会导致虾的大量死亡。为了预防或控制弧菌，养殖户采用了一系列策略。例如，抗生素已被用作弧菌的主要治疗方法之一。但是，过量或不当使用抗生素可能会增加耐药菌株，环境污染和残留物积累。由于诸多弊端，一些替代方法渐渐浮出水面，包括植物提取物，益生菌，多糖，及其他饲料添加剂。但是，这些方法往往效果低，一旦弧菌爆发，虾仍然出现大量死亡。
壳聚糖（CS）是一种天然阳离子多糖，是由脱乙酰基制得，由于其在免疫调节，抗氧化功能，生物相容性和广谱的抗菌活性存在巨大优势，壳聚糖已广泛在水产养殖中应用。
根据国外的研究表明，当在饲料中添加壳聚糖纳米颗粒（每千克饲料添加1克壳聚糖）时，罗非鱼（Oreochromis niloticus）的生长性能和健康状况得到了显着改善。
在Khani Oushaniet al.的研究中，发现补充0.05g壳聚糖（1kg饲料）的饲料方案，可提高虹鳟鱼生长性能和的免疫指标。
然而，以上提到的这些研究主要旨在提高水生动物的免疫力。然而，关于壳聚糖在水生病原细菌上的应用的报道很少，因为据研究报道壳聚糖的抗菌活性很差。但是最近，已报道了一种具有改善抗菌活性的壳聚糖化合物（CS-GT），具有丰富的胺基酸和较高水溶性，并且可以穿透细菌细胞膜并抑制细菌蛋白质的合成。
在2019年，已经成功合成了壳聚糖化合物（CS-GT），与壳聚糖（CS）相比，其水溶性和抗菌活性得到了显着改善。我们通过的研究还发现，CS-GT可以加速伤口愈合，特别是CS-GT可以有效抑制致病性大肠杆菌，绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌。因此，CS-GT可以更广泛用于水产养殖。
本研究的目的是了解CS-GT对副溶血性弧菌感染后对免疫性，肠道组织学以及体内外微生物群的影响，以及它们南美白对虾中生长功能的影响，这些结果有望更好地表明使用CS-GT用于南美白对虾养殖的机制，并为水产养殖壳聚糖衍生物的开发，提供有效的指导。
二、研究的结果与讨论
2.1 水理化质量
水质监测在水产养殖中很重要。水的物理化学成分通常直接促进南美白对虾的生长，比如：pH、氨氮，盐度、总碱度、总氮都是监测水质的重要标准。
实验分为4组进行：
CK组：虾感染副溶血性弧菌后，未采取任何措施；
CS-GT组：虾感染副溶血性弧菌后，添加壳聚糖化合物（CS-GT）；
GT组：添加壳聚糖化合物（CS-GT）后，虾被感染感染副溶血性弧菌；
CS组：虾感染副溶血性弧菌后，添加壳聚糖（CS）。
如图1所示，所有组的pH值在7.66至8.11的范围内，投喂饲料以后，因为过量输入和粪便的大量沉积导致有机物质的积累，分解有机物和虾耗氧量增减，从而导致池塘底部进入低氧状态，大量厌氧细菌繁殖，以及有机物未被完全分解，产生了大量有毒有害的物理化学因素。例如：氨氮和总氮，值得注意的是CS-GT组比起其他组，获得氨氮、总氮的浓度为最低水平。
图1. 水的物理和化学成分：（a）的pH值，（b）盐度，（C ）总碱度，（d）氨氮，（ë）总氮，（˚F）亚硝酸盐。
2.2 血细胞分析
在实验过程中，CK组，CS组，CS-GT组和GT组的死亡率分别约为12％，9％，7％和5％，可能是与体液免疫有关的血细胞在免疫防御系统中，起着至关重要的作用。因此，血细胞可以用来反映虾的免疫应答，并可以降低到感染性病原体或环境应力，从而降低二次感染的危险性。
在这项研究中，每天使用显微镜对每组的总血细胞计数（THC）进行计数。如图2所示，与CK组相比，其他组的THC显着增加（p<0.05）。CS-GT组的THC显着高于GT和CS组（p <0.05）。
图2. 每组虾的总血细胞计数（THC）
如图3所示，CK组显示血细胞凋亡最多，而在CS-GT和GT组血细胞凋亡最少，添加壳聚糖组（CS组，CS-GT组和GT组）细胞凋亡率无显着差异（p>0.05）。结果表明，添加壳聚糖可以有效减少因副溶血性弧菌感染导致南美白对虾的血细胞凋亡。
图3.（a）CK，（b）CS-GT，（c）GT和（d）CS组中血细胞凋亡表
2.3 非特异性免疫参数
抗氧化活性是水生动物抗氧化状态和氧化应激的指标。先前的研究表明，一旦活性氧（ROS）产量增加，生物便能够激活一系列抗氧化剂防御系统，例如：超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽（GSH），谷胱甘肽S-转移酶（GST）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px），能起到预防或修复氧化损伤，并且形成了一线抗氧化剂酶防御系统。因此它是评估水生生物氧化应激状态的标志物。
如图4所示，从感染弧菌后第1天到第3天，CK组的SOD，GSH-PX和GSH活性增加，这可能是由于虾可以产生天然的免疫反应并激活抗氧化剂系统，但其他组相比，CS-GT和CS组的SOD，GSH-Px和GSH活性显着高于CK和GT组（p<0.05）。其中，CS组的抗氧化活性最高。
图4. 每组虾的抗氧化活性
以前的研究表明，各种免疫酶，包括酚氧化酶（PO），酸性磷酸酶（ACP），碱性磷酸酶（ALP）和溶菌酶（LSZ）通常选择作为指示标志，以评估免疫状态和虾抗病能力。ACP和ALP由多种磷酸单酯酶组成，这些对甲壳动物的免疫系统非常重要。
酸性磷酸酶（ACP）是吞噬溶酶体的一个重要组成部分，并且在吞噬作用和血细胞的封装，吞噬溶酶体，因释放发挥杀菌作用。
碱性磷酸酶（ALP）是一种磷酸单酯酶，可在正常生活和吞噬过程中帮助排毒，并有助于许多营养物质的消化吸收。
溶菌酶（LSZ）是无脊椎动物先天免疫系统的组成部分，具有抗菌蛋白的功能。它能水解粘多糖，是细菌细胞壁的基本成分，也可以杀死病原体。
在许多无脊椎动物中，酚氧化酶（PO）代表了宿主主要的防御反应。PO是在PO激活系统中的终端酶，并且能够参与宿主防御反应，例如伤口愈合，吞噬作用等。在这项研究中，每天使用商业检测试剂盒测量每组的免疫酶活性。
如图5所示，CK组的ALP，PO和LSZ活性从第1天到第3天增加，而ACP活性在第1天达到峰值，然后从第2天到第3天下降，但仍高于第1天。结果与之前的研究相似，表明南美白对虾的ACP，ALP和LSM活性与对照组相比增加了。这可能是由于副溶血性弧菌感染导致虾的应激反应，从而引起了免疫反应。在添加壳聚糖组中，CS-GT和CS组的ACP活性显着高于CK和GT组（p <0.05）（图5a），并且在第3天的时候，CS-GT组获得最高的水平（p <0.05）。结果显示，添加壳聚糖组的ALP活性显着高于CK组（p <0.05）（图5b）同时，CS-GT和CS组的LSZ和PO活性显着高于CK和GT组（p <0.05）。
图5. 每组虾的免疫酶活性
总之，本研究中CS-GT组的免疫酶（PO，LSZ，ACP和ALP）活性显着高于CK组。这可能是食用CS-GT后，进一步增强南美白对虾的免疫反应，以消除或杀死病原体的原因。
2.4 肠组织学
脊椎动物的肠道在新陈代谢，营养吸收和免疫功能中起着至关重要的作用。在本研究中，通过苏木精—伊红染色法（H＆E）染色观察了第3天虾的肠道组织学。结果显示，在CS-GT和GT组中，上皮细胞的有一部分脱落并被破坏（图6 b，c）。在CS组的大多数上皮细胞脱落并被严重破坏（图6 d）。
图6.（a）CK，（b）CS-GT，（c）GT和（d）CS组中的显微镜照片
结果表明，服用CS-GT和GT可增强肠上皮细胞和膜的完整性，从而减轻肠道损伤。这可能是由于CS-GT和GT的抗菌作用，并且改善肠道结构和肠道免疫功能。
2.5 微生物群
2.5.1.肠道多样性分析
总共收集了12个水样本和12个肠道样本用于16S rRNA基因测序。经过数据过滤后，分别从水样和肠样中分别获得了80150和80104个高质量读数。
图7. 水（a）和肠道（b）样品的曲线图
表1. 水体和肠中微生物群的多样性指数
2.5.2.Beta多样性分析
Beta多样性用于分析水和肠道样品中微生物群落之间的差异，结果显示CS-GT和GT组的微生物群落相似，CK和CS组的微生物群落相似（图8），这可能与CS-GT和GT都可以抑制革兰氏阴性细菌有关。
图8. 基于对虾Beta多样性分析图
2.5.3.微生物组成和变化
水产养殖环境中存在的细菌在养分循环和有机化合物矿化过程中起重要作用，因此分析每组的微生物组成（图9），对于我们了解虾的变化至关重要。GT和CS-GT组的弧菌含量远低于CK组（图10）。这可能是由于CS-GT和GT对革兰氏阴性细菌有很强的杀菌作用。
图9. 水微生物群落的组成和相对丰度。
图10. 分析了前30个物种中的物种丰富度
肠道菌群在消化，吸收，代谢和抵抗病原体方面起着重要作用。在这项研究中，分析了每组的微生物组成和肠道变化。
图11. 肠道微生物群落的组成和相对丰度
研究还表明CS-GT和GT可能能够改变肠道菌群的结构，并支持潜在益生菌的定殖。此外，弧菌是虾类水产养殖中最重要的疾病之一，并导致全世界虾类严重死亡，弧菌广泛分布于海洋环境中，也可以杂虾消化定殖。如图12所示，弧菌在CK和CS组中占主导地位，而在GT和CS-GT组中则较低。这是因为CS-GT和GT可以抑制革兰氏阴性细菌的生长。
图12. 肠道内前30名中物种丰富度图
2.5.4,微生物功能分析
水和肠道的微生物功能通过PICRUSt2来分析，结果表明，肠道菌群与免疫系统，氨基酸代谢，碳水化合物代谢等众多功能息息相关有关。如图12所示，CS-GT组的免疫系统比CK组更丰富，并且推测CS-GT可以调节虾的免疫相关功能。
图13. 水（a）和肠（b）样品前35位微生物功能图
2.5.5.微生物群落与环境变量之间的相关性分析
进行了典型相关分析（CCA），以确定水和肠道的物理化学组成与微生物群落之间的相关性。结果表明，弧菌浓度与GT和CS-GT剂量呈负关系，CS-GT还可以调节的丰度弧菌，来降低氨氮的毒性。
图14. 水（a）和肠道（b）之间环境因素的（CCA）排序图
三、研究结论：
通过研究表明，在饲料中添加壳聚糖化合物（CS-GT）后，南美白对虾的总血细胞计数，抗氧化活性，免疫酶活性和肠道形态均得到改善。同时，补充壳聚糖化合物（CS-GT）后，南美白对虾水体和肠中弧菌含量显着降低，因此，这种药物必将成为养虾的新利器！
同时，这项研究，为壳聚糖结合物在水产养殖中的未来发展，提供了新的思路。
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