由Enterocytozoon hepatopenaei（EHP）引起的肝胰腺微孢子虫病(HPM)已经在几种虾类当中发现，包括斑节对虾和南美白对虾，并且在包括亚洲国家（例如中国，印度尼西亚，马来西亚，越南，泰国和印度）在内的不同地区报告发现EHP。最近，西半球的委内瑞拉也有发现EHP的报道。
EHP的主要临床症状是生长迟缓，导致虾出现大小不一的情况加剧。有研究表明，EHP与池塘出现的白便症和虾肠道呈现白色状有关。在该疾病的晚期，被EHP感染的虾通常表现出软壳，活力低，饲料摄入减少，空肠道和缓慢死亡。EHP是一种细胞内微孢子虫，可引起肝胰腺小管上皮细胞的损伤。被EHP感染的虾的组织学显示，细胞质内有不规则/规则的嗜碱性包涵体，在HP小管和胃肠道中都可以观察到了孢子的存在。
在已经报告发现EHP的国家（例如印度，中国，越南和委内瑞拉），虾类养殖是在不同的环境下进行的，包括沿海地区，河口以及内陆地区。例如，在印度安得拉邦的某些地区，池塘的盐度可能在0-30ppt之间波动，平均盐度约为10ppt，因为这里池塘的水源主要井水和河口水。相反，在印度西部的某些州，例如古吉拉特邦，盐度可以在30-44ppt之间变化。在西半球的委内瑞拉，养虾场主要分布两个区域。其中一个地区是马拉开波湖，这里的盐度在2-5ppt之间。另一个地区位于该国北部，虾养殖场位于盐度在20-40ppt。有趣的是，在两种不同盐度的环境中均已报告发现EHP。
在这些国家中，高盐度环境中EHP的发病率似乎较高，但是尚无研究支持盐度与EHP之间存在关系。因此，因此，本研究的目的是在实验条件下，采用患有EHP虾的粪便作为疾病传播源，在两种不同盐度下研究虾对EHP的易感性。
一、实验结果：
1、成活率
在两种盐度下，对照组（control，未投放EHP粪便，即未感染EHP组）虾的存活百分比均为100％，挑战组（treatment，投放EHP粪便，即感染EHP组）（#1、#2组）虾的存活百分比90％-950％（表1）。
表1 在两个不同盐度中，南美白对虾的最终存活率。
2、通过qPCR对粪便中EHP进行定量分析
每天从感染ehp的实验池中收集粪便。在两种不同盐度treatment组中，每日粪便样本的EHP均呈阳性。
#1（盐度2ppt，感染EHP组）和#2（盐度30ppt，感染EHP组）的粪便平均重量分别为1.17±0.52g和0.32±0.24 g。在#2中，粪便中的EHP拷贝数量显著高于#1 (p<0.05)。#1粪便中的EHP拷贝数为1.6x103±2.1x103copies/ng。(图1)。
图一
3、组织病理学检查EHP的发病率
通过H＆E组织学评估了使用粪便作为EHP传播源，来研究虾的发病率和严重程度。
在这两个实验中，用传播源的粪便带能够引起SPF虾的疾病。＃1中EHP的患病率为25％，而＃2中为64.3％。因此说明，虾粪便是可以引起EHP的传播。
在＃1中，EHP在2ppt和30ppt盐度下的发病率为25％。在＃2中，EHP在2ppt和30ppt的发病率分别为33％和87.5％。在＃2中，盐度为30ppt时，虾发病的严重程度也更高（表2），有50％虾出现由EHP感染引起的G3级（中度至重度）和G4级（严重）损害。
本研究中不同程度的严重程度如图2所示。图2,A、B和C图显示对照组健康虾的低、中、高倍HP的组织切片，未发现任何组织学病变。相反，在D、E和F图中显示的是EHP感染G1级的组织；在HP内观察到一个聚焦区域(图2D)；图2中的G，H和I显示EHP感染的G2级（低至中度）；图2，J、K和L显示了EHP感染G3级；图2，M、N和O显示出G4级EHP感染（图2M）。
表2 在两种不同盐度的中，南美白对虾被含有EHP的粪便感染后，H＆E组织学评估结果。G0-G4表示严重程度（Lightner，1996）。
图2
4、PCR检测肝胰腺中的EHP
在两种盐度条件下，用感染EHP的虾的粪便，可以让SPF虾的肝胰脏检测均呈EHP阳性，同时，在不同的盐度（2ppt和30ppt）下EHP均可检测到。在对照组中，在2和30ppt盐度下虾的肝胰脏组织，经PCR检测为阴性。
二、该研究的讨论
自2009年以来，由EHP引起的HPM成为一种令经济蒙受巨大损失的疾病，在东南亚的一些主要虾类生产国非常流行，最近，病原体已经传播到委内瑞拉。在东南亚国家，它连同白斑病（WSD）和急性肝胰腺坏死病（AHPND），被评为造成池塘重大经济损失的三大威胁。
南美白对虾是一种广盐性物种，可在多种条件下养殖，包括高盐度（30ppt），河口环境（10-20ppt）和低盐度（2ppt）。在这项研究中，我们研究了两种盐度（高盐度（30ppt）和低盐度（2ppt））中EHP感染的发病率性和严重性。经组织病理学和PCR证实，使用患有EHP虾的粪便足以使两种盐度下的虾患上疾EHP病，因此，这项研究的结果提供了一种新的EHP传染方法，即通过粪便-口途径可以传播EHP。
1、先前的研究表明，EHP可以通过途径水平传播、垂直传播进行传播。在本研究当中，无论是#1还是#2，都可以感染EHP，这明确证实了在盐度2ppt至30ppt下都可以被EHP感染。
2、当用于使用少量粪便时，无论盐度如何，HPM发病率均相似（即25％）（见表1）。但是，当接使用粪便量增加时，在30ppt盐度下EHP感染的发病率增加（87.5％的发病率），而2ppt盐度下只有（33.3％的发病率）。
3、EHP也可以触发其他疾病的攻击，比如：AHPND。在触发AHPND的试验中，需要采用2.0x10 6 CFU/ml的剂量才能引起较高的死亡率（> 90％）。相反，较低的剂量（2.0x10 4 CFU/ml）不会引起高死亡率或组织学损伤。
4、在30ppt盐度下，虾的组织学损害更为严重。在受感染的虾中有50％发现了中度至重度感染（G3-G4）。相比之下，在盐度为2ppt的情况下虾中只有16％表现出G3级感染水平。在两种不同盐度下，EHP感染严重程度的差异可能是由于盐度对孢子的影响不同。孢子数量增加的关键之一是孢子内渗透压的增加，30ppt的高渗压环境可能增加孢子活性来增强孢子数量的增加。
5、EHP，是一种专性的细胞内微孢子虫，可在免疫功能低下时引起胃肠道疾病。还有一些研究人员也报道了盐度变化影响孢子虫的爆发。De Graff等人的研究显示，在0.5N NaCl浓度时，孢子虫的发病率比0.1M NaCl浓度时提高了很多。在我们的研究中，NaCl浓度分别为0.5M NaCl和0.03M NaCl，即分别为30ppt和2ppt，这种发病率的差异可以理解为EHP孢子爆发受到盐度的影响。
6、硬度是本研究另一个变量，可能是影响孢子虫增加的一个因素。低盐度（2ppt）时的硬度约为240mg/L，而高盐度（30ppt）时的硬度约为1575mg/L。另外跟据报道，钙是激活许多细胞活性的第二个重要因素，在较高盐度下，钙是微孢子增加的部分原因。
在亚洲一些EHP流行的地区，盐度的差异很大。例如，在印度，养虾区分别处于高盐度和低盐度两个极端，根据2019年在安得拉邦的观察，EHP的发病率似在盐度较低时(低于5ppt)更低(Aranguren et al.，)。在委内瑞拉的两个主要对虾养殖区，即盐度约为4-6ppt的马拉开波湖地区还未发现EHP，但是在盐度在36-40ppt发现了EHP。
三、研究结论
这项研究表明，被EHP感染虾的粪便，可以将EHP传染别的虾，即可以通过粪-口途径进行EHP传播。同时，尽管在30ppt的盐度下EHP的发病率和严重性较高，但是EHP也可以在低盐度（即2ppt）下发生。这些发现对EHP流行地区的疾病管理，具有重大的意义。
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