目前，益生菌用于治疗细菌性疾病，效果非常明显。在广泛使用的细菌种类中，芽孢杆菌属的适用性，已在多种水生动物中得到证实，尤其是对虾当中。
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芽孢杆菌+壳聚糖在水产养殖中的应用前景
引起的急性肝胰腺坏死病 (AHPND) 的副溶血性弧菌，多年来一直在发生，导致几个全球主要养殖区的虾产量急剧下降。此外，对虾养殖系统中使用的化学品和抗生素等传统疗法也会带来环境风险、耐药性和粮食的不安全性。根据研究结果，基于益生菌或益生元实际应用的有效性，不仅可以用于控制对虾养殖过程中的疾病，还具有提高生长效率、先天免疫力和抗病能力的能力。
合生元被指的是益生菌和益生元的混合物，合生元在水产养殖中的应用是非常多种多样，可促进肠道菌群健康，并且通过胃肠道调节宿主健康，防止生物失调情况的发生，并且在以前的许多研究中都报告了合成生物学的高效率。
然而，益生菌如何长时间储存仍然是一个需要解决的问题，因为物理化学因素会影响细菌的生存能力。因此，为了最大限度地减少益生菌的损失，并提高其有效性，壳聚糖作为一种很有前途的益生菌的包装材料。由于壳聚糖是无毒的、生物相容性和生物可降解性也较强，因此，它可以以相当高的安全用于动物饲料。在以前的研究中，壳聚糖除了用作微生物群落的涂层外，还可以用作高效益生元。此外，其部分水解可提供壳寡糖（COS），具有良好的生物学功能和作用，例如：促进肠道微生物群的生长性能和免疫反应，以及刺激生长。
因此，Kasetsart 大学（泰国）的一个研究小组最近进行了一项研究，以研究添加芽孢杆菌和壳聚糖的益生菌混合物（合生元），对南美白对虾生长性能和免疫反应的影响，并测试它们对AHPND的影响。
02
研究设计
1、研究的南美白对虾（初始重量：3.16±0.86g），虾苗在3000L水箱中驯化1周，盐度为25ppt。驯化期投喂商品饲料，投喂量为体重的3%，每天投喂3次。然后，将60尾虾随机放入15个试验箱中，每3个试验箱为一组，一共有五组。
2、五组虾，分别投喂5种饲料：
对照组：采用市面上的商业虾饲料；
实验C组：在商业饲料中加入壳聚糖；
实验PAC组：在商业饲料中加入短小芽孢杆菌 + 解淀粉芽孢杆菌 + 壳聚糖；
实验PSC组：在商业饲料中加入短小芽孢杆菌 + 枯草芽孢杆菌 + 壳聚糖；
实验ASC组：在商业饲料中加入解淀粉芽孢杆菌 + 枯草芽孢杆菌 + 壳聚糖）
3、虾苗的每天的投喂量为体重的5%，持续5周。然后进行抗副溶血性弧菌试验。
03
研究结果
1、5周后，投喂PSC和ASC饲料的虾在FW、WG、LG、ADG、SGR和FCR与对照组相比，差别较大。然而，PSC组的某些参数值显着高于其他组，尤其是FL、WG、LG和SGR值。此外，对照组虾的FCR显着高于其他组，5周后的存活率（SR）有显着差异，尤其是PSC组和ASC组，虾存活率明显高于其他组。
表1列出了益生菌和壳聚糖混合物对南美白对虾生长性能影响的结果。
2、在实验虾肝胰腺中的Rap-2a和GF-II基因表达如图1所示。Rap-2a基因在喂食PAC、PSC和ASC饲料的虾中表达强烈。另外，PSC和PAC组的DNA复制量显著增加，明显高于其他组值（图2）。
图1. 生长相关基因的实时 RT-PCR 定量分析结果。(A) Rap-2a 和 (b) 肝胰腺中的GF-II基因和 (c) 肠道中的Rap-2a基因。
图2. 实验中16S RNA基因DNA克隆量的实时PCR定量分析结果
3、肠道结构组织学分析的结果表明，喂食合生元组的所有虾，在肝胰腺和腹部都有更好的上皮高度和肠壁厚度（分别为图3和图4）。在研究这些参数时，发现PSC和PAC 组与其他组相比，具有显着更高的上皮高度，对应值为0.074 ± 0.015和0.062 ± 0.025mm（图5a）。然而，仅PAC组的肠壁厚度显着高于其他组，值为0.057±0.022mm（图5b）。
图5. 每组虾上皮高度 (a) 和肠壁厚度
4、在这个实验中观察到肝胰腺组织学的差异，在每个组中观察到独特的结构。在对照组中，F、B和R细胞的肝胰腺组织学不同，管径大小也不同（图6）。C组和ASC组的虾显示出大管和大管腔，以及许多大的B细胞。PAC组显示管径不连贯，不同类型的细胞，主要是F和R细胞。有趣的是，PSC组显示出小管，并且在每只虾中观察到许多具有高度集中的小管和B细胞（图6）。
图6. 与对照组相比，虾的肝胰腺的组织学分析。正常虾肠道的一般生理特征：包括L=腔、B=B细胞、F=F细胞和R=R细胞。
5、在本实验中，评估了合生元对细胞免疫机制的影响，例如：总血细胞计数和吞噬活性 (PA)（图7）。然而，直到该试验结束时所有试验组之间的总血小板计数没有显着差异（图 7a）。PAC、PSC和ASC组的PA在第3周和第5周时显着高于对照组，但与C组无差异（图7b）。至于吞噬指数（PI），仅在第5周观察到显着差异，因为添加PAC和PSC饲料的实验虾，吞噬指数（PI）明显高于在对照组和C组虾（图7c)。
图7：各组对虾免疫学参数分析结果
6、ALF、LSZ、proPO和SOD基因在各器官中的表达情况如图8所示。
图8. 鳃 (a–d) 中四种免疫相关基因（ALF；抗脂多糖因子，LSZ；溶菌酶，proPO；丙醇氧化酶和SOD；超氧化物歧化酶）的实时RT–PCR分析结果 (a–d)）、血细胞(e–h)、肝胰腺 (i–l) 和肠 (m–p)
7、在所有虾感染副溶血弧菌24小时后，PAC、PSC和ASC组的死亡率显着低于对照组，在此期间，只有ASC组的存活率明显高于C组，未感染组的虾没有显示任何死亡率（100%存活率）。另外，从实验组中随机抽取的死虾样本显示出明显的AHPND组织病理学，肝胰腺细胞上皮严重脱落，并观察到大量绿色菌落。
图9. 所有组虾的存活率。
04
总结：
这项研究表明，在虾饲料中补充强效合生元（壳聚糖和芽孢杆菌）， 提高南美白对虾的生长性能，增加免疫相关基因的表达，改善免疫参数的免疫调节，提高VPAHPND感染后的抗病性。这个结果，对于开发提高生长和免疫反应的方法至关重要。
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