张廷青 博士
本文是前篇“国外商业化OPU/IVF生产胚胎研发和推广普及都有哪些最新进展？（1）” 的续篇，重点介绍从商业化角度，如何生产更多的1级和2级OPU/IVF活胚？内容主要分为四部分，我们以下分述之。
一、应用商业化OPU/IVF生产胚胎移植需注意哪些不利影响？
得益于逾10年的不懈探索和努力，商业化OPU/IVF生产胚胎的效率和效果获得了长足进步，加之性控冻精的广泛应用和基因组检测技术的推广普及，全球2018年和2019共24个国家（包括非洲和南美洲9个发展中国家）连续两年商业化OPU/IVF生产胚胎数量超过百万，而且这一势头依然方兴未艾。然而，十三年前商业化OPU/IVF生产胚胎刚起步时却举步维艰、困难重重，几乎停滞不前,主要原因是活胚率低、移植效果差、流产率高、畸犊症多（常见巨犊症）等等。我国由于近几年才开展这项工作，所以对这些不利影响和教训应引以为戒和尽力规避，我们以2008年和2019年发达国家公布的不全统计数据与中国目前的初步结果进行分析比较，自然可以清醒认识到差距在何处？参阅表1，表中COC是卵丘-卵母细胞复合体的英文缩写。
表1.发达国家商业化OPU/IVF生产荷斯坦胚胎部分统计数据与中国目前进展初步结果对照
上述表1数据反映，中国仅用不足2年时间即弯道超车迅即赶上了发达国家近13年研发所取得的当下进步，的确可喜可贺。当然，在首战告捷后我们也需要始终保存清醒头脑，毕竟现时采用的技术并非国内原创技术，绝大部分应该是借鉴国外同行的经长期实践检验的标准流程；此外OUP仪器、IVF实验室主要设备和各类培养基包括促卵泡激素（FSH）均需自发达国家进口；再有，虽然我们的移植妊娠率高达65%，远优于发达国家，但采用的是玻璃化冷冻技术，该冷冻技术流程本身解冻后活胚率就高于程序化冷冻技术流程（也称慢速冷冻技术流程）冻胚解冻后活胚率。然而，在现场实际应用时，与程序化冻胚解冻后就可直接移植受体相比，玻璃化冷冻胚胎美中不足处在于解冻后不能直接移植受体，而需逐步除去防冻剂后重新装枪才能移植受体，这多少有些繁琐，故某种程度不利于大规模推广普及。最后，我国目前的移植总数并不多，移植妊娠率只是早期初步的，还无法收集到流产率、难产率（需要引产或剖腹产）和巨犊率等客观和科学统计数据。
二、为何商用化OPU/IVF生产的胚胎移植后有可能造成受胎率低而流产率、难产率（需要引产或剖腹产）和巨犊率高？
这与人类试管胚胎移植结果基本相似。人类巨婴症分别由美国病理学家J.B. Beckwith1963年和德国儿科医生H.R. Wiedemann1964年首次发现并报道，所以称BWS综合症（Beckwith-Wiedemann Syndrome=BWS）。该综合症临床主要表现为因为胎儿宫内过度生长而致妊娠率低、流产率高、难产率高（需要引产或剖腹产）、巨婴率高和罹患癌症风险率高；其与其它先天性遗传疾病的独异区别是：外脐（Exomphalos）、巨舌症 (Macroglossia)和巨人症 (Gigantism), 所以最初命名该综合症时各取这三项临床症状英文的首字母组成，即EMG综合症，后为纪念前述两位首先发现者，又改为BWS综合症；我一般称为巨婴症，在牛类则称为巨犊症，这是为了方便同道们理解和记忆。人类试管婴儿巨婴症发病风险率高于自然妊娠逾10倍，我们以表2说明。
表2.意大利皮埃蒙特大区妇产科医院2005-2014年巨婴症统计数据
妊娠分类
分娩总数
巨婴症病例数
巨婴症发病率
绝对风险率
相对风险
自然妊娠
371988
31
1:12000
83.3/百万
10.7
试管胚胎妊娠
7884
7
1:1128
887.9/百万
由OPU/IVF胚胎移植所致巨犊病例最早发现于上世纪1990年代，参阅图1。现有证据充分表明：这类巨犊症与母牛妊娠期长短无关；一般认为母牛正常妊娠期为290日前后，如果超过300日就可确定为妊娠期超长；但这类巨犊症的分娩母牛均在预期足月产犊，未有妊娠期超长者。虽然知道问题出在OPU/IVF生产的胚胎，但目前的技术尚无法预估哪枚胚胎移植后可造成这种状况。此外，我们对OPU/IVF胚胎移植所致巨犊症发病率亦缺乏详细统计资料。近来，国外专家对巨婴症/巨犊症病因学主要从分子遗传学方面进入了深入探究，获得了如下进展。
1.巨犊症的主要分子缺陷可分为：
(1)DNA甲基化缺陷约占65%-73%。
(2)染色体内容物变化约占16%-33%。
(3)染色体11p15基因突变约占18%。
以上这些最终会影响印记基因的表达，即导致二次表观突变（表观突变是指基因表达发生改变但不涉及DNA序列变化，能够在代与代之间传递）。
2.主要发生在卵母细胞成熟培养阶段，即减数分裂期。
卵母细胞成熟培养基（IVM）、卵母细胞-精子受精培养基（IVF）和受精卵培养基（IVC）添加血清会更改胚胎印记和非印记基因表达，可导致绵羊IVF胚胎移植受孕产羔时巨羔症发病率高达25%；这也是眼下以上三类培养基为什么不再添加血清的主因，参阅图2。
总而言之，与体内生产胚胎对照组相比，牛卵母细胞体外成熟流程确实不能完全比拟体内环境模型，有一定可能会诱发DNA甲基化和/或基因表达畸变，继之影响后期胚胎或胎儿发育，最终导致巨犊症。
图1左分图示OPU/IVF胚胎移植妊娠足月产犊一落地巨犊症病例：体长斜几乎相当于一成年男子体高75%。巨犊症定义：体重超过正常出生重75%；具体来说，荷斯坦落地犊牛超过68公斤，而安格斯落地犊牛超过55公斤。右分图示OPU/IVF胚胎移植妊娠足月产犊一落地巨犊症病例其它独异畸变：泄殖腔外翻（Cloacal Exstrophy）、外脐（(Exomphalos)和腹直肌分离（Diastasis Recti）。
图2.为什么不主张在培养基中加入血清？左分图a示一组经体外成熟、体外受精并体外培养到第 5 天的胚胎，继之分成两组，其中1组培养基中添入10%发情母牛血清，而另1组则不添加任何血清，两组同时继续培养到第 8 天。结果发现：无血清组正常发育的囊胚较多（中上分图b）；而添加血清组胚胎发育速度过快，造成扩张孵化囊胚较多（下中分图c）,此外，若干这些扩张孵化囊胚还具有突出的内细胞团，如右分图d内箭头所示。
三、如何获得更多1级和2级OPU/IVF活胚？
1.促进供体卵泡波发生同期化和OPU之前给予FSH增强刺激处理
这两项处理措施，尤其是OPU之前肌注FSH做增强刺激处理，效果明显。具体操作流程参阅表3，目前这是最简单和最经济的方案；处理效果参阅表4和表5，以及图3和图4。需要注意的是：这两项措施并不能增加COC数量，但确实可以改进COC质量，从而提高优越活胚产量。
表3.促进供体卵泡波发生同期化和OPU之前给予FSH增强刺激处理流程
(GnRH=促性腺释放激素；FSH=促卵泡激素)
流程时序
流程内容
0日下午4:00
肌注GnRH129微克
第7日下午4:00
肌注GnRH129微克
第9日上午6:00(GnRH肌注36小时后)
育成牛肌注FSH175单位；经产牛肌注FSH233单位
FSH肌注后48-50小时
育成牛OPU
FSH肌注后50-52小时
成母牛OPU
表4.奶牛供体OPU之前给予FSH增强刺激处理效果究竟如何？
表5.肉牛供体OPU之前给予FSH增强刺激处理效果究竟如何？
图3.促进供体卵泡波发生同期化和OPU之前给予FSH增强刺激处理后，可明显发现卵巢上出现较多优质初级卵泡
图4. 促进供体卵泡波发生同期化和OPU之前给予FSH增强刺激处理后，完成体外受精后培养7日可获得较多高质量活胚。
2.OPU操作者必须具有足够实际动手经验
依据北美专家和日籍华裔专家亲身体验和经验，采用以下标准来考核OPU操作者是否有资格独立从事OPU实际操作。这儿需要特别指出的是：COC各个等级回收比率，与供体本身状态关系比较大，如营养、卵泡波周期是否处在退化阶段等；如果真空泵压力、采卵针内径和采卵针针尖斜面均适宜，则应与操作者几无任何关联。
（1）必须积累500头次以上OPU实际动手经验。
（2）OPU回收率达到80%以上（获得COC数/观察到的卵泡数）。
（3）OPU奶牛每次平均回收COC超过15个；而肉牛则应该超过20个。
（4）OPU具体操作时应每针刺破1个卵泡，全程操作总时长平均为5分钟左右。
3.各阶段培养基（成熟、受精和孵育培养）均应除去血清，同时将体外受精流程时长控制在7-10小时范围。
这样不仅可使性控冻精受精卵卵裂率超过75%，并也可获得较多优越活胚和快速发育活胚；体外孵化培养胚胎正常发育速度：IVF后第6日应发育为早期囊胚；IVF后第7日应发育成扩张囊胚；超过这些发育阶段的活胎，如孵化囊胚或扩张孵化囊胚，则称为快速发育活胚，参阅图5和图6。
图5.各阶段培养基（成熟、受精和孵育培养）均应除去血清，同时将体外受精流程时长控制在7-10小时范围，这样不仅可使性控冻精受精卵卵裂率超过75%，并也可获得较多优越活胚。
图6. 各阶段培养基（成熟、受精和孵育培养）均应除去血清，同时将体外受精流程时长控制在7-10小时范围，这样不仅可使性控冻精受精卵卵裂率超过75%，并也可获得较多快速发育活胚：一般IVF后第7日正常发育胚胎应达到扩张囊胚阶段，代码为7；而本图7枚活胚中，3枚因快速发育却达到了孵化囊胚阶段，代码为8。
4.注意正确评估胚胎发育阶段和质量，尽量避免误判，如图7和图8所示。
图7.示2个1级萎陷扩张囊胚（7-1），无经验者因观察到胚体萎陷而卵周隙区域增加，故会轻易误判为退化胚胎。
图8.各阶段培养基（成熟、受精和孵育培养）均应除去血清，同时将体外受精流程时长控制在7-10小时范围，这样不仅可使性控冻精受精卵卵裂率超过75%，并也可获得较多优越胚胎和快速发育活胚；IVF后第5日如能发育为紧密桑葚胚（左分图），则在IFV后第7日应该可发育成1级扩张囊胚（右分图）。四、如何提高商业化OPU/IVF生产胚胎移植成功率？
1.荷斯坦供体IVF后第6日或第7日不同发育阶段胚胎移植成功率如何？
参阅表6和表7，为获得较高移植成功率，请格外注意黄色区域并牢记以下要点：
（1）宜选择受体发情后第7日或第8日进行移植。
（2）如使用IVF后第7日胚胎，宜选择囊胚（代码6）、扩张囊胚（代码7）、孵化囊胚(代码8)和扩张孵化囊胚（代码9）进行移植。
（3）如使用IVF后第6日胚胎，宜选择早期囊胚（代码5）、囊胚、扩张囊胚和孵化囊胚进行移植。
表6.荷斯坦供体IVF后第7日不同发育阶段胚胎移植成功率如何？
表7. 荷斯坦供体IVF后第6日不同发育阶段胚胎移植成功率如何？
2.娟姗供体IVF不同发育阶段胚胎移植成功率如何？
显而易见，囊胚、扩张囊胚和孵化囊胚移植成功率远高于桑葚胚和早期囊胚，参阅表8，注意黄色区域。
表8. 娟姗供体IVF不同发育阶段胚胎移植成功率如何？
胚胎发育阶段
桑葚胚和早期囊胚
囊胚、扩张囊胚和孵化囊胚
妊娠数
417
577
妊娠率
45.3%
56.7%
3.是否快速发育IVF活胚移植成功率较高？
回答是肯定的，参阅表9。
表9.是否快速发育IVF活胚移植成功率较高？
IVF后第7日
移植统计数据
胚胎发育阶段
移植数
妊娠数
妊娠率
孵化囊胚
272
160
59%
孵化扩张囊胚
257
150
58%
合计
529
310
59%
4.泌乳牛受体胎次和分娩后天数不同是否影响IVF胚胎移植成功率？
总体而言，泌乳牛宜选择1-2胎且产后65日以上受体可获得较好移植效果，仅需应用定期移植处理流程一次；如未妊娠，则下次发情改为冻精配种。参阅表10，注意黄色区域。
表10.泌乳牛受体胎次和分娩后天数不同是否影响IVF胚胎移植成功率？
5.季节不同是否影响IVF胚胎移植成功率？
依据表11和表12统计数据（注意黄色区域），基本可以得出如下结论：如果选择1级扩张囊胚或1级孵化囊胚进行移植，则任何季节均可获得较满意妊娠成功率。
表11.季节不同是否影响IVF胚胎移植成功率？
表12.寒冷或酷热是否影响IVF胚胎移植成功率？
6.移植技术员操作经验不同是否影响IVF移植成功率？
回答是肯定的，参阅表13，注意黄色区域。对移植技术员需要熟练掌握的主要技术环节如下。
（1）准确判断功能性黄体位于受体哪侧卵巢？最好在移植前1天直检，藉以避免移植时临时检查而过度干扰受体造成子宫发生局部应激。
（2）移植位点越接近黄体同侧子宫角顶端越好，但应尽量避免子宫内膜损伤。
（3）移植枪退出后枪尖不可粘附任何血迹。
（4）移植流程时长不可超过1分钟，宜越短越好。
表13.移植技术员操作经验不同是否影响IVF移植成功率？
7.为何需要认真做好IVF移植成功率记录？
IVF移植记录远较冻精配种记录复杂，每次移植结束后需尽量记录一切细节，这对今后分析移植成功率高低极有帮助。表14是美国加州一家荷斯坦注册良种奶牛场今年从1月29日至8月27日总共14次IVF鲜胚移植妊娠成功率记录，注意分析黄色区域可得出如下结论。
（1）5月7日和5月21日移植妊娠成功率较低应归咎于供体OPU之前未使用FSH做增强刺激处理，终致IVF活胚质量较差；这从而反证了OPU之前应用FSH做加强刺激处理，不仅能够增多优质IVF活胚数，还能提高移植妊娠成功率。
（2）6月18日至8月27日，尽管天气炎热，但IVF鲜胚移植妊娠成功率远高于同期冻精配种情期受胎率；这进一步证明了在炎热夏季应用IVF胚胎移植同样可获得较满意妊娠成功率，从而一举解决了夏季炎热天气冻精配种情期受胎率低的世代难题，做到一年四季都可使适配母牛及时妊娠。
表14.美国加州一家荷斯坦注册良种奶牛2021年1月29日至8月27日
总共14次IVF鲜胚移植成功率记录，注意黄色区域注释。
五、本文小结和建议
1.应用GnRH对供体做卵泡波同期化处理和OPU之前应用FSH做增强刺激处理，虽不能增加COC产量，但却可以获得较多高质量COC和IVF活胎。
2.严格控制实验室操作流程质量：采用无血清M、F、C培养基和将IVF流程缩短为7-10小时，藉以获得更多优越活胚和快速发育活胚。
3.IVF后第6日应发育为早期囊胚，IVF后第7日应发育成扩张囊胚，这属正常发育速度活胚；如果超过正常预期发育阶段，则属快速发育活胚；虽然快速发育活胚移植成功率效果不错，但目前并无相关流产率、引产/难产率和巨犊率等研究资料，所以仍需继续观察获得客观准确结论。
4.应选择受体发情后第7日或第8日进行移植。
5.育成牛受体应观察自然发情后只进行首次移植或二次移植，如未妊娠再改为冻精配种。
6.泌乳牛受体只限于1-2胎并产后>70日（荷斯坦）或>60日（娟姗）进行同期移植流程处理后做首次移植，如未妊娠再改为冻精配种。
7.如使用IVF后第7日活胚，宜选择囊胚、扩张囊胚、孵化囊胚和扩张孵化囊胚进行移植。
8.如使用IVF后第6日活胚，宜选择早期囊胚、囊胚、扩张囊胚和孵化囊胚进行移植。
9.酷暑季节应尽可能移植1级扩张囊胚和孵化囊胚。
10.应选择既往常规配种成绩良好的牛群进行移植。
11.不断反复强化移植人员技术培训。
12.努力做好移植流程所有细节记录。
来源 | 荷斯坦杂志
