罗正中 四川农业大学动物医学院博士研究生
张廷青 博士
初检一旦剔除了那些未受精卵和质量低劣不可移植胚胎，应及时全神贯注检视那些剩下的质量可以满足鲜胚移植或冷冻保存胚胎。当然，我们期望所有可鲜胚移植或冷冻保存胚胎质量等级均为1级。然而，逾半个世纪的鲜胚移植或冷冻保存实践积累的海量资料无可争辩地证实这只是一厢情愿。大量可鲜胚移植或冷冻保存胚胎中往往存在相当数量的“瑕不掩瑜”优质胚胎；尽管这些“瑕不掩瑜”优质胚胎由于存在某些非重要缺陷而可能导致其质量等级降低到2级甚至3级，但依然有可能移植成功并产出正常健康发育活犊。那么如何定义1级胚胎呢？本质上，1级胚胎理应完美无缺，不存在任何瑕疵，胚胎移植实践中亦能获得不少这样的1级胚胎。图1-14展示了各种各样可鲜胚移植或冷冻保存胚胎，同时也图解了哪些瑕疵将造成可鲜胚移植或冷冻保存胚胎等级降低；同时为便于准确识别，许多图片将1级胚胎、2级胚胎、3级胚胎和未受精卵同框对照比较，藉以加深感性印象。造成可鲜胚移植或冷冻保存胚胎降级的瑕疵有：大小反常胚胎卵裂球；胚胎细胞质内出现较大单个液泡或多个液泡（Lipids in the Cytoplasm）；胚胎细胞中出现单个或多个细胞退化；一些细胞与构成胚胎基本细胞团失联（即挤出的卵裂球/细胞）；以及透明带损坏、破裂或畸变（Misshapen or Flat Zona Pellucida and Cracked Zona Pellucida）。毋庸置言，许多可鲜胚移植或冷冻保存胚胎的确存在细微瑕疵，例如少量挤出细胞（Extruded Cells）。因此，胚胎质量分级不仅要考虑这些瑕疵存在与否，还应考虑这些瑕疵对胚胎移植成功率究竟影响如何。例如，经验表明，胚胎多数细胞正常但只有少量退化细胞，依然可以获得较高移植成功率并生产出正常健康发育犊牛。以下我们分述哪些OPU/IVF胚胎属可鲜胚移植或冷冻保存胚胎？哪些瑕疵存在无关紧要，并不严重影响鲜胚移植或冷冻保存效果？
通常情况下，胚胎的所有细胞均会紧密粘附一起并相互交换信息。然而，在某些情况下，有些细胞并不参与其同源细胞的正常胚胎发育进程。那些完全不参与正常胚胎发育过程的细胞因与其余同源细胞分道扬镳而被剥离压迫挤出胚体，滞留在卵周隙之间，故称为挤出细胞。挤出细胞往往损伤胚胎正常发育潜力，尤其是在胚胎发育早期阶段出现挤出细胞。因此，挤出细胞大小和数量多寡直接影响胚胎质量等级。挤出细胞通常无分裂，其可发生自2细胞胚胎开始后的任何胚胎发育阶段。不过，只要胚胎中含有大量健康正常发育的卵裂球，即使存在挤出细胞，依然属于可鲜胚移植或冷冻保存胚胎；移植成功率取决于挤出细胞大小和数量多寡。检视胚胎是否存在挤出细胞或挤出细胞大小和数量多寡时，需轻轻往复滚动胚胎，藉以从不同视角观察。图1-图5分别示具有挤出细胞瑕疵的不同质量等级胚胎。
图1.左分图示一个2级早期桑葚胚（3-2），箭头所指为一大卵裂球，该卵裂球业已停止分裂，而其它同源卵裂球形成早期桑葚状；右分图示一个2级桑葚胚（4-2），箭头所指为数个被挤出胚体的卵裂球。
图2. 左分图示一个3级桑葚胚（4-3），箭头所指右侧是胚胎细胞群（将来发育成内细胞团），其被左侧和左上侧大量挤出细胞复盖，如不滚动该胚胎，极易将该胚胎误判为4级桑葚胚（4-4）；右分图示一个4级桑葚胚（4-4），箭头所指左侧为一小型胚胎细胞群，而右侧则存在巨量挤出细胞。
图3.（a）和（b）各示一个1级囊胚（6-1），如果囊胚和扩张囊胚存在挤出细胞，并且胚胎细胞团（将来发育成内细胞团）还未萎陷，则这些挤出细胞往往被压迫靠近透明带而难以清晰辨识；如（a）所示：若未充分滚动该胚胎进行详细检视，就极难发现囊胚腔，加之挤出细胞遮盖在胚体之上，往往会将这类胚胎误判为未受精退化卵子。
图4.左上分图示一个几近完美的7日龄1级桑葚胚（4-1；400xDIC）：可见极少数卵裂球被挤出卵黄膜；该胚胎因卵裂球膨胀而引起卵黄膜表面呈现连绵非规整性凸凹，这是与未受精卵细胞鉴别的要点之一；此外，仔细观察胚体还可发现大量融合的卵裂球。左上中分图示另一个完美的1级桑葚胚（4-1；40xBF）：该桑葚胚在12点钟位点可见一个卵裂球被挤出；该胚胎可进行鲜胚移植，亦可冷冻保存，效果均佳。右上中分图示左上中分图那个完美1级桑葚胚放大100倍的细微结构（100xDIC）：注意由膨胀的小卵裂球引致卵黄膜表面呈现非规整性凸凹。右上分图示两个对照鲜明的胚胎（200xBF）：上方为一个1级桑葚胚（4-1），可看到若干小卵裂球自卵黄膜内朝外凸起；下方为一个未受精卵细胞，可看到包裹卵质的卵黄膜表面光滑。左下分图所示也是一个近乎完美的1级桑葚胚（4-1；100xDIC）：该桑葚胚的卵黄膜似乎像未受精卵细胞的卵黄膜一样光滑，像这种桑葚胚很容易与未受精卵细胞相混淆，鉴别要点是需仔细观察有无卵裂球从卵黄膜内朝外凸起，在该胚胎4点钟位点可发现轻微凸起；此外，在该胚胎2点钟位点也有两个微小的挤出卵裂球。左下中分图示一个2级桑葚胚（4-2；40xBF）：因该胚胎存在几个挤出的卵裂球，故使其质量等级从1级降到2级。右下中分图示一个3级桑葚胚（4-3；40xBF）。右下分图示右下中分图的那个3级桑葚胚放大100倍的细微结构（100xDIC）：黄色箭头所指均为挤出的未融合卵裂球；将该胚胎滚动检视还可发现更多挤出的未融合卵裂球；因为中央区域健康融合卵裂球团（实际是内细胞团）占据卵裂球总数一半，所以质量等级为3级。
图5.左上分图示一个6.5日龄1级早期桑葚胚（3-1；40xBF）：该胚胎仅有2个挤出的死亡卵裂球。左上中分图示左上分图的那个1级早期桑葚胚放大100倍的细微结构（100xDIC）。右上中分图示两个7日龄3级早期桑葚胚（3-3；100xDIC）：黄色线条标示区域示这两个胚胎的健康卵裂球融合团（将来会发育为内细胞团）；可看出上方胚胎比下方胚胎具有更清晰的卵裂球融合团；在两个胚胎的卵裂球融合团之外，则是被挤出的卵裂球；如果以360°检视这些卵裂球能看到其外径的话，则应判定其已被挤出、未融合或业已发生死亡。右上分图示一个7.5日龄3级早期桑葚胚（3-3；100xDIC）：黄色线条标示区域示该胚胎健康的卵裂球融合团，可发现该卵裂球融合团大约有6-8个融合卵裂球，这远低于所期望的至少超过60个卵裂球，故可判定该胚胎为发育迟缓胚胎。左下分图示一个7日龄3级桑葚胚（4-3；100xDIC）：黄色线条标示区域示该胚胎的健康卵裂球融合团；而黄色箭头所指为三个挤出卵裂球，滚动检视该胚胎背侧，可发现另外两个业已死亡的卵裂球；此外，健康卵裂球融合团占据卵裂球总数不足50%，故该胚胎质量等级为3级。下中分图示一个2级桑葚胚（4-2；400xBF）：按理说，因为健康卵裂球融合团清晰地被卵黄膜复盖包裹（黄色线条所示区域），该胚胎质量可评估为1级而非2级；但美中不足的是该胚胎具有两个大的挤出卵裂球（黄色箭头所示）；滚动该胚胎检视发现其胚体背侧还有两个更小的卵裂球；这是胚胎质量分级中主观误判的极好范例。右下分图示另一个2级桑葚胚（4-2；400xBF）：黄色线条标示区域示该胚胎的胚体质量上乘，但由于该胚胎透明带呈椭圆形，故质量等级降1级。
如果胚胎的透明带失去圆球状或呈扁平状，或表面有凹陷裂纹，这些缺损均会导致该胚胎粘附培养皿或细管上，则通常判定该透明带发生了损伤、破裂或畸变。这种缺陷本身就足以导致胚胎质量降低一级，例如从质量等级 1降至质量等级 2。通常，破裂的透明带仅在孵化囊胚（发育阶段代码8）中发现。然而，一些胚胎在较早发育阶段也可能会出现破裂的透明带，大概是由于冲卵回收流程压力过高所致。胚胎只有具有完整透明带方可进行适当清洗消除病原体而符合出口标准要求；不过，这些具有透明带破裂的胚胎仍然可以在国内进行鲜胚移植或冷冻保存。需要注意的是：具有透明带裂纹瑕疵的胚胎质量评定并非一定要强行自动降级。图6-图11分别示具有透明带损坏、破裂或畸变瑕疵的不同质量等级胚胎。
图6. 箭头所指为2级早期囊胚（5-2），因透明带畸变而降级。
图7.左分图箭头所指是一个1级早期囊胚（5-1）的透明带裂纹瑕疵。中分图示一个7日龄早期桑葚胚，箭头所指为该胚胎透明带裂纹瑕疵。右分图示从一头发情后7日供体采集到的所有胚胎：箭头所指为一个具有透明带裂纹瑕疵的1级扩张囊胚（7-1）；判定为扩张囊胚的依据是其直径稍大和透明带变薄。
图8.左上分图示一个1级桑葚胚（4-1；40xBF）：黄色箭头所指为该胚胎透明带裂纹瑕疵；同时，该胚胎的胚体虽质量上乘，但仍可发现三个挤出卵裂球；因该胚胎透明带存在裂纹瑕疵，故将不会允许出口其它国家。左上中分图示左上分图那个1级桑葚胚放大100倍的细微结构（100xDIC）：箭头所指可清晰发现该胚胎透明带裂纹瑕疵。右上中分图示两个不同发育阶段的1级胚胎（40xBF）：上方为1级早期囊胚（5-1）；下方为1级桑葚胚（4-1）。右上分图示右上中分图的那两个胚胎放大100倍的微细结构（100xDIC）：注意在上方胚胎4点钟位点（黄色箭头标示）开始形成囊胚腔，所以该胚胎发育阶段为早期囊胚。左下分图示一个3级桑葚胚（4-3；400xDIC）：在该胚胎5点钟位点的透明带破裂，导致大约三分之一的胚体逸出，透明带破裂可能是缘于采集胚胎过程冲卵液压力过高所致，当然也可能归因于透明带本身脆弱；此外，仍可在该胚胎卵周隙内发现几个挤出卵裂球；因该胚胎透明带存在破裂瑕疵，故将不会允许出口其它国家。左下中分图示一个1级早期囊胚（5-1；200xBF）：黄色箭头标示的 “空心区域” 是早期发育囊胚腔。右下中分图示另一个1级早期囊胚（5-1；100xDIC）。右下分图示一个3级早期囊胚（5-3；400xDIC）：该胚胎中的活卵裂球业已分化且形成一个囊胚腔（黄色线条标示的左下方空洞和毗邻区域）；其余卵裂球未融合和发生死亡。
图9.左上分图示两个1级早期囊胚（5-1；100xDIC）：因为左侧胚胎的囊胚腔占据胚体约50%，所以也可以考虑是1级囊胚（6-1）。上中分图示八个不同发育阶段的胚胎（100xDIC）：1号和2号均为未受精卵细胞；3号为2级桑葚胚（4-2），该胚胎自1点钟至5点钟区域均有挤出的死亡卵裂球，同时沿着这一区域边缘的卵黄膜难以辨认并具有一种 “磨损” 外观，从而使得死亡的卵裂球和卵裂球碎片可以逸出胚体进入卵周隙。4号为1级早期囊胚（5-1），囊胚腔位于该胚胎自12点钟至6点钟区域，约占胚体空间的三分一。5号为2级桑葚胚（4-2），在该胚胎胚体的右侧边缘和腹侧边缘均存在挤出细胞。6号为1级桑葚胚（4-1），在这个位面检视该胚胎未见任何瑕疵。7号为1级早期囊胚，因囊胚腔占胚体空间略低于50%，故发育阶段难以判定为囊胚。8号为1级桑葚胚（4-1），该胚胎几近完美，卵黄膜表面仅呈现略微不规整。右上分图示一个1级囊胚（6-1；200xDIC）：黄色箭头标示的是囊胚腔，颜色较浅的囊胚腔体积略大于内细胞团，这是区分早期囊胚和囊胚的重要标准；蓝色箭头标示的是滋养层；而红色箭头标示的是内细胞团。左下分图示另一个1级囊胚（6-1；400xBF）：在该胚胎自10点钟至11点钟区域存在一个大的挤出卵裂球（见黄色箭头标示位置），由于胚体生长和扩张占据卵周隙空间，故该挤出卵裂球被压扁；红色箭头标示的是独特的滋养层细胞，这些细胞属于首先明显分化为特定细胞类型（胎盘）的胚胎细胞。下中左分图也是一个1级囊胚（6-1；100xDIC）：该胚体囊胚腔大小约是内细胞团块的两倍，胚体已生长到使卵黄膜贴附着透明带，从而难以观察到卵周隙；然而，由于透明带还没有外溢扩张和变薄，因此该胚胎发育阶段仍被分类为囊胚而非扩张囊胚；需要注意的是因为这类胚胎难以观察到卵周隙，所以往往被列为1级胚胎；事实上，这是由于任何挤出卵裂球夹在卵黄膜和透明带之间均被压扁几无痕迹而极难被发现。下中右分图示一个2级囊胚（6-2；100xDIC）：尽管该胚胎胚体本身无瑕疵，但在9点钟位点的透明带严重破裂和撕破，导致该胚胎质量等级从1级降到2级；同时，该胚胎缘于此而不符合出口其它国家的质量标准要求。右下分图示一个3级囊胚（6-3；100xDIC）：当对该胚胎进行滚动检视时，很容易发现囊胚腔略大于内细胞团（黄色线条标示区域）；此外，全部卵裂球大约50%业已发生死亡，故该胚胎质量等级定为3级。
图10.左上分图示一个1级扩张囊胚（7-1；100xDIC）：该胚胎囊胚腔约占胚体70%空间，而内细胞团（黄色箭头标示）则相对较少，仅约占胚体30%空间；胚体一直扩张到透明带，迫使透明带相应伸展和变薄，藉以适应胚体生长发育；始自内细胞团边角一层薄的滋养层，沿着整个囊胚腔外缘延伸，同时贴近透明带内缘（黄色弧形标示）。上中分图示一个1级扩张囊胚（7-1；100xDIC）：该胚胎囊胚腔和透明带之间的滋养层更清晰可见，黄色线条区域标示内细胞团。右上分图示发情后第8天采集到的一头超排供体所有胚胎（40xBF）：箭头所示均为扩张囊胚，注意这些扩张囊胚的透明带直径增加并变薄；当然，透明带直径大小增加和厚薄均为主观判定；因人而异会有一定偏差。左下分图示8个发育不同阶段的1级胚胎（100xDIC）：1号为1级扩张囊胚（7-1）；2号为1级囊胚（6-1）；3号为1级早期囊胚（5-1）；4号为1级囊胚（6-1）；5号为1级囊胚（6-1）；6号为1级囊胚（6-1）；7号为1级扩张囊胚（7-1），注意与相邻胚胎的直径相比较；8号为1级早期囊胚（5-1）。下中图示3个1级扩张囊胚（7-1）和3个2级扩张囊胚（7-2）的相互特征比较（100xDIC）：绿色箭头标示均为1级扩张囊胚（7-1），而黄色箭头标示均为2级扩张囊胚（7-2）；两者相互比较，可发现2级扩张囊胚（7-2）囊胚腔呈褐色颗粒状外观；这些褐色颗粒状外观是由死亡细胞碎片和退化细胞被紧密地夹在滋养层和透明带之间形成的；而1级扩张囊胚的囊胚腔却呈半透明外观。右下分图示一个1级孵化囊胚（8-1；400xBF）：该胚胎在6点钟至8点钟区域因透明带受囊胚生长发育持续挤压而破裂。
图11.左分图示四个不同发育阶段胚胎（100xDIC）：1号为空壳透明带，可在9点钟位点发现撕裂；注意1号透明带比2号1级扩张囊胚（7-1）和3号1级扩张囊胚（7-1）两者的透明带均更薄；4号为无透明带的孵化囊胚（8-1）；而1号空壳透明带可能是原来包裹4号孵化囊胚的透明带。右分图示一个1级孵化囊胚（8-1；400xBF）：这是一个几乎完美无缺的孵化囊泡，正常情况下，囊胚腔与内细胞团的占比将高于该胚胎。
尽管脂质是细胞膜的重要组成部分，并且必须存在于活胚胎中，但一些胚胎的若干细胞的细胞质内存在异常积累的脂滴（也称为液泡）。大多数情况下，若液泡出现较多，则该胚胎质量等级会降1级；细胞质脂质含量高可能是冷冻胚胎移植成功率降低原因之一（娟姗牛更明显）。图12示胚胎的某些细胞内存在液泡。
图12.左分图示一个1级早期桑葚胚（3-1），箭头所指为该胚胎细胞的细胞质内存在液泡；右分图右上方示一个未受精卵细胞，左下方示一个2级囊胚（6-2），箭头所指为该胚胎细胞的细胞质内存在液泡；如不滚动仔细检视该胚胎，极易误判为未受精退化卵子。
常能看到胚体呈不规整形状，在囊胚阶段囊胚腔形成期间尤为常见。囊胚腔萎陷被认为是正常生理过程，不会自动降低质量等级，除非透明带也发生畸变。图13示两个胚体不规整胚胎。
图13(A)示一个7日龄1级早期囊胚（5-1）：胚体形状略欠规整；（B）示一个7日龄2级早期囊胚（5-2）：胚体形态和透明带形态均发生畸变。
冲卵采集胚胎时，往往可见一些胚胎的透明带外表面粘附异物，这些粘附异物可能是粘液、个体细胞或组织团块。透明带外表面粘附异物可能表明供体罹患子宫内膜炎，或正常配子移输过程中未去除卵丘细胞，或仅仅只是脱落的供体子宫内膜细胞。透明带外表面的粘附异物通常可以洗掉，有时可能需要使用 0.25% 胰蛋白酶溶液进行洗涤；只要清洗流程靠谱（需严格遵照国际胚胎技术学会制定的清洗指南），理应可将透明带外表面粘附的异物包括病原体全部清除。需要指出的是：透明带外表面存在粘附异物不一定影响胚胎质量定级；但是，任何带有粘附异物的胚胎均不可在国内进行鲜胚移植或冷冻保存，更不允许出口。理论上，OPU/IVF胚胎透明带外表面罕见粘附任何异物。图14示两个胚胎透明带外表面粘附异物。
图14.左分图示一个碎片化未受精卵细胞：箭头所指为粘附在透明带外表面的白细胞。右分图示一个7日龄1级早期囊胚（5-1）：箭头所指为粘附在透明带外表面的子宫内膜细胞，这些细胞在做鲜胚移植或冷冻保存前必须清除。
1.究竟哪些OPU/IVF胚胎可鲜胚移植？
（1）对胚胎质量有哪些要求？
A.1级胚胎、2级胚胎和3级胚胎均可做鲜胚移植，但移植成功率随胚胎质量降低而对应递减。
B.具有透明带损坏、破裂和畸变瑕疵的胚胎可做鲜胚移植，但禁止冷冻保存出口。
C.透明带外表面粘附异物的胚胎做鲜胚移植或冷冻保存前，务必将异物清洗除尽。
（2）对胚胎发育阶段有哪些要求？
桑葚胚、早期囊胚、囊胚、扩张囊胚和孵化囊胚均可做鲜胚移植，但以早期囊胚和囊胚移植成功率最高。
2.究竟哪些OPU/IVF胚胎可冷冻保存？
（1）仅限于1级胚胎和2级胚胎。
（2）具有透明带损坏、破裂和畸变瑕疵的胚胎可冷冻保存，但仅限于当地使用，严禁外流和出口。
我们下期继续论述异常卵细胞/胚胎形态学特征，以及如何依照国际通用规则标记中国自产OPU/IVF胚胎。
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