【荷斯坦◆技术】张廷青：应用牛活体采卵技术需要注意哪些细节？(2)

近期发表的一系列科普文章基本只是牵涉牛第三代辅助繁殖技术（OPU/IVF），而与同道们现时日常工作中操作的牛第一代辅助繁殖技术似无密切联系。不过，牛第三代辅助繁殖技术并非屠龙之技，其在发达国家和某些发展中国家业已逐步广泛推广应用多年，并获得巨大经济效益。为落实我国牛品种遗传改良规划，目前国内也正尝试加速引进，故而同道们需要掌握和应用牛第三代辅助繁殖技术只是迟早的事。鉴此，提早了解这套技术的基本原理和操作流程对同道们将来学习和顺利掌握之定有助益。我们以下论述本文主题。

不言而喻，每次实施OPU，均希望能获得较多高质量卵母细胞。然而，诸多因素会影响卵母细胞回收率、卵母细胞质量和卵母细胞后续发育潜力，本文将简洁阐述这些影响因素。

一、如何判断卵母细胞质量优劣？

体外生产胚胎可否获得成功很大程度上取决于原材料质量优劣如何，即卵母细胞本身质量优劣如何。卵母细胞质量优劣一般分为四级，参见图1所示。这四类质量优劣不等的卵母细胞自然合乎逻辑地对应其胚胎发育成功率，参见表1所示。

图1.牛卵母细胞如何分级？1级：>4层卵丘细胞（左上分图）；2级：1-3层卵丘细胞（右上分图）；3级：无卵丘细胞的裸卵母细胞（左下分图）；4级：卵丘细胞扩散（右下分图）。

表1.牛不同等级未成熟卵母细胞受精和胚胎发育潜力如何？

同列百分率数值右上角abc代表相互比较统计学差异显著：P<0.025。

二、哪些因素影响OPU卵母细胞回收率？

1.不同品种是否影响OPU高质量卵母细胞回收率？

业已充分证实：牛不同品种是影响OPU-IVF效率主要因素之一，参见表2所示。

表2.奶牛和肉牛OPU-IVF效率是否存在明显差异？(2019年全球统计数据)

2.卵泡直径大小不同是否影响OPU高质量卵母细胞回收率？

既往一系列不同研究业已确定卵泡直径大小和卵母细胞发育潜力之间的相互关系。当OPU采集直径>2-3毫米卵泡时，所获卵母细胞发育潜力随着卵泡直径增加而提高，并且发育为胚胎的成功率更高。一般认为：OPU采集直径>8毫米卵泡所获卵母细胞的发育潜力较强。为什么OPU采集小卵泡所获卵母细胞发育潜力较低呢？这可能缘于这些卵母细胞尚未完成减数分裂和细胞质成熟过程，或者这些卵母细胞来自已经发生闭锁的卵泡。许多研究已经表明：直径<110微米卵母细胞可能仍处于生长期，故受精后发育能力较差。表3和表4的统计信息为以上论述提供了有力证据。

表3.卵泡直径大小不同对OPU高质量卵母细胞回收率影响如何？

同列百分率数值右上角abc代表相互比较统计学差异显著：P≤0.05。

表4.卵泡直径大小不同对OPU卵母细胞发育潜力影响如何？

同列百分率数值右上角abc代表相互比较统计学差异显著：P≤0.05。

3.季节不同是否影响OPU高质量卵母细胞回收率?

久已证明：热应激对牛卵母细胞和胚胎有害。常常观察到：荷斯坦奶牛秋季繁殖性能低于冬季，这可朔源到夏季高温造成卵母细胞发育潜力受损。同样，秋初OPU获得的卵母细胞质量较差，而随着冬季临近，OPU获得的卵母细胞质量逐渐提高，我们用图2和表5证实之。

图2.夏秋和冬春对OPU卵母细胞发育潜力影响如何？

（*示两个季节统计学差异极其显著：P<0.001。）

表5.季节差异对OPU卵母细胞发育潜力影响如何？

4.日粮组分差异是否影响OPU高质量卵母细胞回收率？

牛营养学家早已阐明：日粮能量和蛋白质配比不同会影响母牛血浆胰岛素、类胰岛素样生长因子（IGF）-I和尿素浓度；母牛血浆中这些物质的浓度变化会影响早期胚胎发育。曾有研究观察到：日粮能量和蛋白质配比变化可引发母牛卵巢IGF系统变化并增加卵泡内IGF生物利用度，从而提高卵泡对促卵泡素（FSH）的敏感性。高能量日粮可增加母牛外周血胰岛素和IGF-I浓度，这些变化自然会加速卵巢优势卵泡生长。与卵泡生长发育趋势相比，随着营养供给增加，卵母细胞质量则出现下降趋势，部分原因归咎于高蛋白日粮导致血浆尿素浓度升高，参阅表6所示。显然，许多机理涉及到调节日粮能量和蛋白质配比对母牛卵巢功能的影响。故而，尝试制作优化牛繁殖能力的日粮配方时，必须全面周详考虑：营养供给对卵泡生长和卵母细胞质量的不同影响，以及母牛体况。

表6.日粮组分差异对OPU卵母细胞发育潜力影响如何？

5.年龄大小不同是否会影响OPU高质量卵母细胞回收率？

尽管落地犊牛卵巢窦腔卵泡中含有可完全生长发育的卵母细胞，但体外胚胎生产实践中的结果令人完全失望。卵母细胞发育潜力与供体母牛月龄或年龄密切相关：3-4月龄初情期前处女牛卵母细胞发育潜力低于经产牛；而7-11月龄期间的荷斯坦处女牛，其卵母细胞发育潜力与经产牛相似。总体而言，经产牛直至13岁，其OPU获取卵母细胞数量始终稳定；不过，14-18岁经产牛OPU卵母细胞数量则逐渐减少。此外，经产牛直至18岁，其OPU所获卵母细胞发育潜力并无显著变化。

6.外源性生殖激素处理是否会影响OPU高质量卵母细胞回收率？

外源性FSH处理供体母牛后可显著改进OPU高质量卵母细胞回收率，这在许多商业化牛体外胚胎生产公司业已成为常规流程中重要环节之一。鉴于我国目前尚未完全娴熟掌握OPU/IVF实操流程，加之FSH需要进口且价格不菲，本文暂不论述。

我们后续文章将介绍操作因素如何影响OPU高质量卵母细胞回收率，包括合理选择真空度高低、采卵针直径大小和采卵针针尖角度等等。

▍本文来源：荷斯坦杂志