免疫荧光（Immunofluorescence，IF）主要原理是利用荧光标记的抗体作为探针对组织或细胞内特定抗原进行定位和定性分析，由于其具有特异性强、敏感性高、速度快等优点，广泛用于科学研究。

免疫荧光原理及应用

免疫荧光（Immunofluorescence，IF）是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一种强大的技术，主要原理是利用荧光标记的抗体作为探针对组织或细胞内特定抗原进行定位和定性分析，由于其具有特异性强、敏感性高、速度快等优点，广泛用于科学研究（如测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质）。随着多重免疫荧光技术的兴起和发展，在临床诊断上的应用也越来越丰富（根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等）。

图1：免疫荧光技术实验原理（间接法）。图片来源J Invest Dermatol. 2013 Jan;133(1):e4.

图2：Confocal 检测U2OS细胞 KRR1 (A4487，KRR1 Rabbit pAb)，β-Actin (AC004: β-actin Mouse mAb)，DAPI 染核。图片来源于ABclonal官网

图3：多重免疫荧光检测乳腺癌组织ER，PR及HER2蛋白表达水平。图片来源：Daniel M Spagnolo, 2016,J Pathol Inform.

常言道万事开头难，今天给大家总结一些师兄师姐才知道的独门诀窍！

一

免疫荧光基本操作流程

二

免疫荧光检测方法

直接法

优点：操作简便，一步法，多染时不受抗体来源限制

缺点：信号强度低

间接法

优点：信号强度中等，适用于双重免疫染色

缺点：两步法，受抗体来源限制，背景可能变高

Tips：荧光标记二抗与一抗的种属要匹配

酪酰胺信号放大技术（TSA）

优点：信号强，多染时不受抗体来源限制

缺点：需要摸索条件，可能带来背景或非特异染色

三

知己知彼——背景查询

（一）实验前需要对待检测蛋白信息进行查询

这是重要且必要的一步，以便于了解靶点蛋白表达情况（是否特异性表达，是否需要条件刺激，表达丰度如何以及亚细胞定位）。

（二）靶点查询网站The Human Protein Atlas

HPA数据库亮点

（1）十二大版块分类齐全
（2）常用版块（组织，细胞，病理）一网打尽
（3）不做实验也能看到实验结果

基于组织的人类蛋白质组图谱

来自44种正常人体组织类型的蛋白表达数据基于免疫组化的抗体蛋白分析。涵盖15323个基因(76%)的蛋白质数据都有可用抗体。mRNA表达数据来自256种不同正常组织类型的RNA (RNA-seq)深度测序。

1.进入HPA主页面，选择“TISSUE”

2.在“The tissue section - Tissue-based map of the human proteome”页面，查看详细介绍

人类细胞系的表达谱

细胞系部分包含有关1055种人类细胞系（包括985种癌细胞系）中人类蛋白质编码基因的全基因组RNA表达谱的信息。

转录组学分析包括基于27种癌症类型的特异性分析的分类、所有细胞系的分布和表达聚类分析以及针对选定癌症类型的细胞系与其相应癌症类型的相似性分析。

1.在HPA数据库主页面选择“CELL LINE”版块

2.在“The cell line section - Explore the expression profiles in human cell lines”页面，查看详细介绍

3.点击“Brain cancer ”进入主页面后，查看与脑癌相关的细胞系

以线粒体标志物HSP60/HSPD1为例进行详细介绍

1.在HPA主页面输入HSP60/HSPD1，点击“Search”

2.选择搜索名称的最佳匹配项，进入HSP60/HSPD1主页面

3.在HSP60/HSPD1主页面选择“Tissue Atlas”版块，查看其在各个组织器官的表达情况

4.在HSP60/HSPD1主页面选择“CELL LINE”版块，查看其在各个细胞系中的表达情况

5.在HSP60/HSPD1主页面选择“SUBCELLULAR”版块，可看到其在各细胞系中的表达水平与亚细胞定位情况

6.赛特新思数据库输入关键信息也可以查询靶点亚细胞定位信息

种草好物

A0564 HSP60/HSPD1 Rabbit mAb

应用：IF/ICC, IHC, WB

物种：Human, Mouse, Rat

<左滑查看更多>

四

多方验证——对照实验

对照实验可以帮助确认样品之间的唯一变量是否在实验变量范围内，以及包括抗体在内的试剂是否达到我们预期效果。实验对照包括药物处理、添加胞外配体来调控信号转导通路，或比较基因表达（Knock-out、siRNA等）不同的细胞。

阳性对照：用确认含有待测抗原的组织或细胞，与待测样本进行统一处理，结果应显示阳性，可证明待测抗原有一定活性并且实验过程中使用的试剂和方法均可靠。

阴性对照：用明确不含有待测抗原的细胞或组织切片染色，结果若为阴性，可排除染色过程中由于非特异性染色造成的假阳性结果

Tips：实验对照的设计和引入，有利于原因排查，同时会使实验结果更严谨及更有说服力。

种草好物

A21107 Acetyl-Histone H3-K9 Rabbit mAb

应用：IF/ICC,ChIP,WB,DB

物种：Human,Mouse,Rat,Other (Wide Range)

<左滑查更多>

注：HeLa细胞使用TSA刺激处理

（TSA:组蛋白去乙酰化酶抑制剂,促进组蛋白及非组蛋白的乙酰化修饰）

自发荧光:

自发荧光:指当无任何实验性荧光基团时，包括组织和细胞在内的材料发射出本底荧光的一种现象，这种自发荧光会降低信噪比；

自发荧光物质:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH )／烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH )、黄素和黄素蛋白、细胞外基质蛋白弹性蛋白和胶原质及脂褐质等；

Tips:自发荧光一般在较短波长通道（发光颜色为绿色／黄色／橙色）中表现最强

解决方案：

设置未染色的样品为空白对照，检测自发荧光
封闭液中可添加甘氨酸或使用非醛类固定液

所选抗体标记的荧光与样本自发荧光光谱之间避免重叠

旧甲醛溶液易产生自发荧光，及时更换新鲜配制的甲醛固定液

固定后，对样本充分洗涤，去除残留固定液

更换自发荧光低的器皿

五

重中之重——抗体选择

根据样本选择一抗：

一抗选择需满足IF应用，一抗种属应尽量选择与检测样本不同来源，从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应。

举例说明：检测小鼠样本，则尽量避免选择小鼠或大鼠源的一抗（如果选了同种属一抗建议加个同型对照)，最好选兔源的一抗，则二抗则可选择偶联了检测分子（荧光素、生物素等）的抗兔IgG。

根据一抗种属选择二抗：

对于多色分析，原则上一抗尽量来源于不同种属，且荧光标记二抗与一抗的种属要匹配，避免二抗发生交叉反应；两种抗体荧光素的光谱重叠效应应最小。

Tips：实验前最好先验证单标对特定组织或细胞是否有效，再进行多标实验。

如果采用TSA技术，则不需要考虑一抗种属来源问题。

根据一抗类型与亚型：如果一抗是IgM，就选择抗IgM二抗。
二抗的类型：细胞或组织表达Fc受体较高，全长二抗的Fc端容易与Fc受体结合，选择F(ab)2片段抗体避免非特异性结合。
二抗的纯化方式：经交叉吸附处理的二抗在纯化后再次通过固定了其他种属的血清或抗体的纯化柱，降低种属间交叉反应，在多色分析具有突出的优势。
荧光基团：选择光谱不重叠且稳定明亮的荧光基团；颜色搭配时也要适当考虑强弱搭配。

USO1 Rabbit mAb (A20950)

应用：IF/ICC,IHC,WB

物种：Human, Mouse, Rat

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