食管癌的发病率在全球排名第八，是癌症相关死亡的第六大原因。其中，食管鳞状细胞癌(ESCC)是最常见的类型。尽管早期诊断、手术技术和放化疗等方法都取得了进步，但食管鳞癌的预后仍然很差，5年生存率为15%-25%。淋巴结转移患者的预后往往比没有发生转移的患者差。转移淋巴结的数量和比例已被证明是重要的预后因素。食管鳞癌的发生和发展是一个复杂的、多阶段的过程，涉及复杂的通路和机制，目前尚未完全阐明。因此，亟需在临床工作中发现实用的生物标志物和新型的治疗靶点，以提高患者的预后结果。
肉豆蔻酰化富丙氨酸的C激酶底物类似物-1（MARCKSL1）是MARCKS家族的一员，在功能上，磷酸化的MARCKSL1能够使F-肌动蛋白成束,增强其稳定性,并提升丝状伪足的运动能力。据报道，在上皮细胞中，MARCKSL1在细胞间和细胞-底物间影响细胞骨架的形成，可能与细胞运动相关。在生理条件下，MARCKSL1能够调节肌动蛋白的稳态，调控细胞粘附、神经元的迁移，促进丝状伪足及板状伪足的形成，在神经系统的早期发育中起着至关重要的作用。此外，MARCKSL1还与多种癌症的进展有关，如乳腺癌、前列腺癌和肝细胞癌，并已被证明是某些类型疾病患者的预后因子。新的证据表明，MARCKSL1参与食管鳞癌的进展，但MARCKSL1在食管鳞癌进展中的潜在机制尚不完全清楚。
为了探究MARCKSL1是否调控食管鳞癌的进展，作者首先在体外分析了MARCKSL1对食管鳞癌进展的影响。作者通过western blotting检测了MARCKSL1在食管鳞癌细胞中的表达水平，结果表明，MARCKSL1在KYSE140细胞中表达最高，而KYSE30和KYSE150细胞的MARCKSL1表达较低。然后，通过siRNA在KYSE140细胞中使MARCKSL1表达敲除，并进行了qPCR和western blotting验证。CCK8实验结果显示，MARCKSL1的表达缺失在短时间内并未显著抑制KYSE140细胞的增殖。Transwell和细胞划痕实验结果均表明，与阴性对照相比，MARCKSL1的表达敲除显著降低了细胞的侵袭和迁移能力。综上所述，这些结果表明，MARCKSL1的下调可显著抑制食管鳞癌细胞的侵袭和迁移。
2、MARCKSL1表达的上调增强了食管鳞癌细胞的体外侵袭和迁移
将MARCKSL1 (MARCKSL1过表达，OE)或空载体(阴性对照，NC)瞬时转染入KYSE30和KYSE150细胞，并通过western blotting进一步验证了MARCKSL1在KYSE30和KYSE150细胞中的过表达。与MARCKSL1的表达敲除对KYSE140细胞增殖的影响一致，MARCKSL1的过表达在短时间内并没有增强KYSE30和KYSE150细胞的增殖，而MARCKSL1的过表达显著促进了细胞的迁移和侵袭。结果表明，MARCKSL1与食管鳞癌细胞的体外转移呈正相关。
3、MARCKSL1调控细胞的运动和迁移
为更好地了解MARCKSL1调控食管鳞癌进展的潜在机制，作者通过siRNA在KYSE140细胞中将MARCKSL1表达敲除后，使用RNA测序进行了转录组分析。与阴性对照比较，以p≤0.01，差异倍数≥1.2或≤0.83为筛选标准，共鉴定出800个差异表达基因，其中上调基因351个，下调基因449个。接下来，作者对800个差异基因进行KEGG通路分析，发现差异基因在细胞衰老和TNF、MAPK、NF-kappa B信号通路中显著富集。然后，作者研究了MARCKSL1对MAPK信号通路的影响，发现MARCKSL1的表达缺失显著降低了MAPK信号通路的关键蛋白：RRAS2、NRAS和FOS的mRNA和蛋白表达水平。western blot分析显示，MARCKSL1的表达敲除可抑制MEK、JNK和ERK的磷酸化，但不影响其表达水平，提示MARCKSL1的表达敲除可显著抑制MAPK信号通路的活化。此外，GO分析表明，800个差异基因显著富集于：细胞分化、细胞因子介导的信号通路、细胞迁移和运动等方面，这与表型实验结果一致，说明MARCKSL1的表达上调可增强食管鳞癌细胞的体外侵袭和迁移。GSEA分析表明，通过siRNA使MARCKSL1的表达敲除可显著增强上皮表型，例如：MARCKSL1的表达敲除可显著促进食管鳞癌细胞的顶端连接。综上所述，这些结果表明，MARCKSL1调控了食管癌细胞的运动和迁移。
4、MARCKSL1通过增加侵袭性伪足形成和ECM降解而促进食管鳞癌的侵袭和转移
肿瘤细胞的转移能力部分依赖于对细胞外基质的侵袭。MARCKSL1已被证明与F-actin相互作用，增强肌动蛋白的稳定性和细胞迁移。为了进一步确定MACKSL1是否通过与F-actin相互作用而促进食管鳞癌的进展，作者进行了免疫荧光实验。实验表明，内源性MARCKSL1与F-actin在体内外的食管鳞癌组织和细胞中共定位。已有研究证明，F-actin参与了侵袭性伪足的形成，因此作者初步推测MARCKSL1可能也参与侵袭性伪足的形成，进而调控食管鳞癌的进展。Cortactin是侵袭性伪足的重要标志物。作者通过免疫荧光染色分析了Cortactin在MARCKSL1过表达 (MARCKSL1-OE)细胞的细胞膜中的表达。结果提示，MARCKSL1过表达显著增加了F-actin和Cortactin在细胞膜上的共定位，尤其是在迁移细胞的前沿，表明MARCKSL1介导了侵袭性伪足的形成。此外，与侵袭性伪足形成的细胞数量的增加相一致的是，MARCKSL1的过表达也增加了每个细胞明胶降解的面积。这些数据进一步证实，MARCKSL1的过表达显著促进了侵袭性伪足的形成和细胞外基质降解。
5、MARCKSL1的高表达与食管鳞癌患者的转移和预后不良相关
为了探索MARCKSL1是否调控食管癌患者的肿瘤进展，作者从TCGA的GDC中获得转录组测序的FPKM值，并进行log2转换，分析了TCGA数据库中MARCKSL1的基因表达水平。分析表明，食管癌组织(n=182)中MARCKSL1的mRNA表达水平明显高于癌旁非肿瘤组织(n=286)。接下来，作者使用免疫组织化学方法在组织芯片中检测了MARCKSL1的表达。分析表明，与癌旁非肿瘤组织(n=442)相比，MARCKSL1在食管鳞癌组织(n=811)中表达明显增加。此外，MARCKSL1在40例食管鳞癌患者(n=40)的新鲜组织切片中的表达也被证实显著升高。为了进一步研究MARCKSL1是否调控食管鳞癌进展，作者对MARCKSL1的表达与临床病理特征进行了相关性分析。分析表明，MARCKSL1的表达与分化程度显著相关，分化较差的食管鳞癌患者的MARCKSL1表达较高。同时，MARCKSL1的表达与淋巴结转移呈正相关，提示MARCKSL1促进了食管鳞癌的侵袭。Kaplan-Meier生存分析显示，MARCKSL1高表达(n=220, IHC评分>6)的食管鳞癌患者的生存率低于MARCKSL1低表达(n=464, IHC评分≤6)的患者(p=0.0222)。MARCKSL1在淋巴结转移阴性乳腺癌中具有重要的预后价值。为了探讨MARCKSL1的蛋白水平是否与无淋巴结转移的食管鳞癌患者的预后相关，作者还对378例淋巴结转移阴性的食管鳞癌患者进行了Kaplan-Meier生存分析，结果显示，MARCKSL1表达越高，生存率越低。然而，MARCKSL1的表达与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、TNM分期等临床病理特征均没有相关性。总之，作者的结果表明，MARCKSL1参与了食管鳞癌的进展，尤其是伴有淋巴结转移和预后不良的食管鳞癌。
在本文，作者证明了MARCKSL1通过与F-actin和corectin相互作用，促进细胞迁移和侵袭，从而调控侵袭性伪足的形成和ECM的降解，进而促进食管鳞癌的转移。MARCKSL1高表达与淋巴结发生转移的食管鳞癌患者的预后不良呈正相关。作者提出，MARCKSL1可作为一种新的食管鱗癌候选标志物和潜在的治疗靶点,可以辅助食管癌的诊治和改善患者的预后。
参考文献
Zhao Y, Xie X, Tian L, et al. MARCKSL1 interacted with F‐actin to promote esophageal squamous cell carcinoma mobility by modulating the formation of invadopodia[J]. Cancer Medicine, 2022.
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