这些蛋白质互作实验方法，你都了解吗？

蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)对解析生命活动过程与疾病发生发展过程至关重要。随着时代发展，虽然大规模、高通量的生物学研究手段大大促进了蛋白质相互作用的预测，但这种预测还需要进一步利用体外和体内系统进行验证。分析蛋白质互作的方法多种多样，本篇文章为大家介绍以下几种互作分析技术：

免疫共沉淀 Co-IP

免疫沉淀 (IP) 、免疫共沉淀 (Co-IP) 和pull-down 都是常用的从复杂的混合样品中获取目标分子，以进行下一步分析的方法，如检测蛋白质能否相互作用。在此类实验中，被研究的蛋白质称为“诱饵”蛋白，“诱饵”蛋白的互作蛋白称为“猎物”蛋白。“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白结合后，利用靶蛋白—抗体—Protein A/G—磁珠/琼脂糖珠的结合方式获取复合物，再通过SDS-PAGE、Western blot 或质谱等方法进一步对复合物中的靶蛋白进行分析。

免疫共沉淀方法简单，是识别感兴趣蛋白质的相互作用、深入了解其结构和功能的初步实验方法。但是它也有相应的局限性，比如很难验证两种蛋白质是否直接发生相互作用、不能得到这种相互作用亲和力等定量信息等。因此需要在相互作用分析与筛选后，使用其他方法验证更详细的相互作用信息。

图1：使用抗体进行 Co-IP 与使用 Strep-Tactin®XT 进行pull-down

融合蛋白沉降 pull-down

IP和Co-IP通过固定抗体来捕获诱饵蛋白质及其结合分子，而pull-down可使用带亲和标签的目的蛋白进行，在体外验证蛋白间的直接相互作用。Pull-down是通过磁珠/琼脂糖填料固定带有标记的“诱饵”蛋白，从细胞裂解液、纯化蛋白或表达系统中捕获“猎物”蛋白，然后将复合物蛋白分离后进行凝胶或质谱分析，从而确认互作蛋白的 “身份”。Pull-down较Co-IP的优点在于，不仅能证实靶蛋白的直接相互作用，且洗脱条件也很温和，保留蛋白质结构与天然蛋白复合体的同时，又避免将非特异性结合的蛋白质共同洗脱下来，确保了后续分析的准确性。这一优点在Strep-tag技术中充分体现。图2为应用MagStrep“type3”XT 磁珠进行蛋白质Strep pull-down步骤图。

图2：Strep pull-down互作蛋白质分析示意图。

A: Strep-Tactin®XT包被磁珠；B: 固定带有Twin-Strep-tag®标记的“诱饵”蛋白；C: 孵育“诱饵”蛋白与含有“猎物”蛋白的溶液；D: “猎物”蛋白与“诱饵”蛋白形成复合物；E: 复合物蛋白进行凝胶分析；F: 复合物蛋白进行质谱分析

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图3：SPR检测原理与Strep-Tactin®XT包被的感受器晶片

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图4：BLI传感器与 Strep-Tactin®XT 相结合，特异性捕获 Twin-Strep-tag® 融合蛋白

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