一种与肝癌相关的血清外泌体tsrna标志物、探针及其应用
发明领域
1.本发明属于分子生物学领域，涉及一种与肝癌相关的血清外泌体tsrna标志物、探针及其应用。
背景技术：2.肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, hcc)占原发性肝癌的比例最高，到2020年，hcc在全球肿瘤相关死亡病例中占第三位，发病率居全球第六位。hcc仍然是包括中国在内的东亚地区的常见癌症之一，其发病率、患病率和活动性均显著高于其他地区。被诊断为早期的肝癌可以通过切除或者肝移植的方式治疗，相较于晚期肝癌5年生存率更高。目前ct、超声、mri等影像学技术已被应用于hcc的早期诊断，但这些技术很难发现直径≤1cm的病灶，不足以在早期阶段检测hcc。临床仍然缺乏敏感的诊断方法或生物标志物。
3.外泌体是一类直径50
‑
200 nm的双层膜结构囊泡，几乎所有的细胞都可以分泌外泌体，且其已经在包括血清、尿液、乳汁等多种体液中被发现。近年来，多项研究表明外泌体在细胞间通讯、肿瘤微环境调节中发挥了重要作用。外泌体及其内含物同样被报道可以作为多种疾病的标注物。
4.研究表明，血清外泌体中存在多种非编码小rna，其中包括rna
‑
derived small rnas (tsrnas)。tsrna是一类新发现的长度约为14~40个核苷酸的非编码rna，来源于trna前体和成熟trna。最近的研究表明，tsrnas在乳腺癌、肺癌、b细胞淋巴瘤等多种癌症中异常表达，提示tsrnas可能参与了这些疾病的发生和发展。然而，血清外泌体tsrna在肝癌无创诊断中的应用前景仍有待发掘，如果能筛选到肝癌中异常表达的血清外泌体tsrnas作为生物标志物，并研发相应的诊断试剂盒，对肝癌的诊断现状将会有极大的推动。
5.
技术实现要素：6.本发明的主要目的是针对肝癌临床无创诊断中出现的问题，提出一类与肝癌相关的血清外泌体tsrna标志物、以及该类tsrna标志物在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。
7.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种与肝癌相关的血清外泌体tsrna 标志物，所述的血清外泌体tsrna 标志物为以下序列中的中的任意一种或组合：trf
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ser
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gct
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005：seq id no.1；trf
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pro
‑
tgg
‑
010：seq id no.2；trf
‑
ser
‑
gct
‑
024：seq id no.3。
8.本发明提供了一种探针，所述探针能特异性捕获包括上述的与肝癌相关的血清外泌体tsrna 标志物。该探针是由applied biosystems 公司定制合成的taqman tsrna探针。
9.本发明提供了上述的血清外泌体tsrna 标志物、探针在肝癌诊断试剂盒制备中的应用。本发明提供了一种肝癌诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测血清外泌体中的上述的
tsrna 标志物的一种或多种的表达量。
10.进一步的技术方案，所述的试剂盒中包括上述的探针。
11.进一步的技术方案，所述的试剂盒还包括pcr 反应常用的试剂和酶。
12.进一步的技术方案，所述的试剂盒包括dntp/amv逆转录酶及缓冲液、mgcl2、depc 水和taq 酶等。
13.本发明的有益效果：本发明提供的血清外泌体tsrnas标志物作为肝癌诊断的标志物的优势在于：(1) 与传统蛋白生物标志物及血清mirna不同，存在于血清外泌体中的tsrnas本身具有极佳的稳定性，有助于抵抗血清中大量存在的rna酶的降解，表达稳定、易于检测，是一种新型生物标志物，且定量精确，肝癌特异性血清外泌体tsrna表达谱的识别及鉴定将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，有助于肝癌的辅助诊断，为其他疾病生物标志物的研制提供参考。
14.(2) 本发明研究了血清外泌体tsrnas在肝癌诊断中的作用，揭示了其对肝癌筛查和诊断的临床价值。因此，本发明获得了稳定存在与血清的肝癌外泌体tsrnas标志物；通过血清外泌体tsrnas 生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得肝癌的诊断更加方便易行。
15.(4)血清外泌体tsrnas 试剂盒是一种全面系统的诊断和监测试剂盒，可用于肝癌患者的辅助早期诊断，有助于反映肝癌患者的疾病状态，为临床治疗提供更好的支持。
16.附图说明
17.图1为肝癌病人组与健康对照组血清外泌体中表达差异最显著的30种tsrna的测序热图。
18.图2为3种外泌体tsrna在肝癌病人组与健康对照组血清的表达水平。
19.图3为3种tsrna分别对肝癌病人和健康对照组的诊断效果的roc图。
20.图4为trf
‑
pro
‑
tgg
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010和trf
‑
ser
‑
gct
‑
024组合使用对肝癌病人和健康对照组的诊断效果的roc图。
具体实施方式
21.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
22.实施例1一种与肝癌相关的血清tsrna 标志物，所述的血清tsrna 标志物为以下序列中的中的任意一种或组合：trf
‑
ser
‑
gct
‑
005：seq id no.1；trf
‑
pro
‑
tgg
‑
010：seq id no.2；trf
‑
ser
‑
gct
‑
024：seq id no.3。
23.一种探针，所述探针能特异性捕获包括上述的与肝癌相关的血清tsrna 标志物。该探针是由applied biosystems 公司定制合成的taqman tsrna探针。
24.上述的血清tsrna 标志物、探针在肝癌诊断试剂盒制备中的应用。
25.一种肝癌诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测血清外泌体中的上述的tsrna 标志物的一种或多种的表达量。
26.所述的试剂盒中包括上述的探针。所述的试剂盒还包括pcr 反应常用的试剂和酶。所述的试剂盒包括dntp/amv逆转录酶及缓冲液、mgcl2、depc 水和taq 酶等。
27.本发明首先分离了肝癌病人及与病人年龄性别等信息匹配的健康对照的血清外泌体，提取rna进行tsrna测序分析，经过初步筛选后通过大样本进行验证，进而筛选出一组与肝癌高度相关的且具有较高敏感性和特异性的tsrna标志物，并基于此研发出可应用于肝癌临床诊断的试剂盒，为肝癌的筛查和早期诊断提供基础。
28.本发明解决问题的技术方案包括：(1)以标准操作程序(sop) 采集符合标准的血样，系统收集完整的临床病例信息资料。
29.(2) 血清外泌体tsrna差异表达谱筛选分析：筛选肝癌患者、与肝癌患者年龄性别相匹配的健康人对照，分离血清，通过测序分析血清外泌体tsrna表达谱，筛选出差异表达的tsrnas并通过大样本进行多阶段验证。
30.(3) 对前面筛选到的差异表达的血清外泌体tsrnas进行定量分析，明确与肝癌发病相关的tsrnas。
31.(4) 基于以上筛选到的血清外泌体tsrna，研发诊断试剂盒。
32.本发明按照sop收集符合标准的血样，收集完整的病理学资料(包括年龄、性别、病理类型、who分级、tmn分期等)，接着采用小rna高通量测序、real
‑
time pcr等方法进行检测。
33.具体来说包括以下几个部分：(1) 收集病人样本：
①
经影像学诊断、病理学确认的肝癌病例；
②
所有样本为术前，未经放化疗和新辅助治疗的；
③
健康对照为与病人年龄性别匹配的正常人。本研究共采用100例符合标准的肝癌病人血清样本进行研究。
34.(2)使用试剂盒（沉降法）提取100ul血清外泌体，进而用trizol(invitrogen life technologies)法提取外泌体总rna。
35.(3)rna质量检测：通过变性琼脂糖凝胶电泳检测28s和18s核糖体rna条带。
36.(4)小rna高通量测序：
①
将以上提取的总rna 进行page 电泳回收；
②
tsrnas被大量的rna修饰，会干扰小rna seq文库的构建。在对总rna样本进行文库准备之前，先进行以下处理：将链接引物(adaptor prime) 酶联在小rna 分子的3
′
与5
′
端：所有srna文库构建和深度测序均由aksomics(中国上海)完成。测序文库的大小选择用于rna生物类型测序使用自动凝胶切割器。利用安捷伦生物分析仪2100对这些文库进行了严格的定量分析。根据安捷伦生物分析仪2100构建srna文库。illumina nextseq仪器标准小rna测序，测序类型为50bp单读。
37.③
进行rt
‑
pcr 反应后进行测序
④
数据分析与处理(5)qrt
‑
pcr方法
①
提取血清外泌体总rna，通过rna 逆转录反应得到cdna 样品；
②
使用applied biosystems 公司的taqman tsrna茎环引物进行逆转，合成cdna；
③
使用applied biosystems 公司的taqman tsrna荧光探针进行pcr反应；
④
检测比较肝癌患者与健康正常对照血清外泌体样本中tsrna 的表达变化。
38.(6)制备肝癌tsrna诊断试剂盒
①
前期通过小rna高通量测序检测肝癌患者和正常对照之间的拷贝差异和表达差异的tsrna，通过qrt
‑
pcr 技术进一步对肝癌患者和健康对照中差异较显著的血清tsrna进行检测，作为辅助肝癌诊断的指标。最后筛选到与肝癌相关的血清tsrna组成诊断标志物trf
‑
ser
‑
gct
‑
005、trf
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pro
‑
tgg
‑
010和trf
‑
ser
‑
gct
‑
024。在此基础上研发肝癌诊断试剂盒，该试剂盒包括3个tsrna的探针，寄amv逆转录酶、taq 酶、mgcl2，depc 水和dntp 等试剂。
39.(7)数据分析所有统计检验均使用graphpad prism软件7(圣地亚哥，ca)进行。数据以平均值
±
sems表示。p < 0.05为差异有统计学意义。组间样本的正态性和等方差分别用shapiro
‑
wilk检验和brown
‑
forsythe检验进行评估。当样本组间达到正态性和方差相等时，采用单因素方差分析(随后采用bonferroni多重比较检验)、双因素方差分析(随后采用bonferroni多重比较检验)或t检验。
40.以下是本发明进一步的说明：在探索阶段，发明人分别对30例肝癌血清外泌体和30例健康对照血清外泌体，运用小rna高通量测序，通过筛选发现有30种tsrnas（细胞质的tsrnas来自gtrnadb数据库；线粒体的tsrna由transcan
‑
se软件预测产生）在肝癌血清样本中发生显著变化（变化倍数>2，结果如图1所示）。
41.根据测序结果，发明人选择了在肝癌患者中表达升高的tsrnas进行分析（升高倍数>2），挑选3种tsrna可以由applied biosystems 公司定制合成相应的taqman探针进行检测，包括trf
‑
ser
‑
gct
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005、trf
‑
pro
‑
tgg
‑
010和trf
‑
ser
‑
gct
‑
024。
42.采用绝对定量方法对以上3种tsrnas进行检测，基于以下两种方法，对有统计学显著差异的tsrnas在另外24例肝癌病例和24例对照中进行进一步进行验证，进而观察本研究结果的稳定程度。
43.(1)血清外泌体提取：使用试剂盒（沉降法）提取100 ul血清样本中的外泌体，trizol法进一步提取外泌体中的rna。
44.绝对定量分析:合成相应的tsrna标准品，制作标准曲线，通过qrt
‑
pcr检测，得到样本ct 值，通过标准曲线计算得到绝对浓度。最终筛选出的tsrnas 包括：trf
‑
ser
‑
gct
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005、trf
‑
pro
‑
tgg
‑
010和trf
‑
ser
‑
gct
‑
024，序列如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3所示根据以上结果，接着在另外100例健康对照和150例肝癌患者血清中对上述两种tsrna进行进一步检测验证，结果显示trf
‑
ser
‑
gct
‑
005、trf
‑
pro
‑
tgg
‑
010和trf
‑
ser
‑
gct
‑
024在肝癌样本中显著升高，结果如图2所示。
45.进一步分析上述三种tsrnas用于肝癌诊断的效果，roc 曲线(receiver operatingcharacteristiccurve，受试者工作特征曲线)分析发现trf
‑
ser
‑
gct
‑
005、trf
‑
pro
‑
tgg
‑
010和trf
‑
ser
‑
gct
‑
024对肝癌有较好的诊断效果，结果如图3所示。
46.进一步分析trf
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pro
‑
tgg
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010和trf
‑
ser
‑
gct
‑
024组合使用对于肝癌诊断的效果，roc 曲线(receiver operatingcharacteristiccurve，受试者工作特征曲线)分析发现组合使用同样对肝癌有较好的诊断效果，结果如图4所示。
