单域抗体的特性及其临床开发进展

来源

中国新药杂志 2019 年第28 卷第21 期

作者

陈哲浩，李林鸿，曹王丽，金朱明，方玲，杨军，王如伟，尚云龙

杭州贝罗康生物技术有限公司

浙江康恩贝制药股份有限公司

杭州师范大学医学院

浙江省子宫恶性肿瘤诊治技术研究中心

摘要

单域抗体是指一类在骆驼科动物体内发现的天然缺失抗体轻链和重链恒定区的重链抗体。

通过免疫骆驼科动物或噬菌体展示技术，可以筛选得到针对特定抗原的特异性单域抗体。

单域抗体不但具备常规单抗所具有的特异抗原识别能力，并且因其分子尺度小、结构简单而具备很多独特的优点及用途，但也因此在体内易被快速清除，半衰期短。

目前在研的治疗类单域抗体往往采用多特异性分子联结、结构修饰或者融合蛋白的设计策略来延长体内半衰期，拓展特异性。

本文重点对治疗类单域抗体的结构特点、应用优势及其作为新型抗体药物在国内外临床开发进展进行综述，并对其应用开发前景进行展望。

关键词

单域抗体; 纳米抗体; 重链抗体重链可变区; 单域抗体偶联; 半衰期

正文

1993 年，Hamers 实验室发现，骆驼血清中除了常规的四联抗体外，还有大量类似免疫球蛋白G( immunoglobulins，IgG) 的分子。

这类分子天然缺失传统抗体轻链和重链恒定区( heavy chain constant region，CH) 的一部分，但仍具备对抗原的强结合力，且所有骆驼科动物都能产生这类重链IgG 分子，被称为重链抗体( heavy-chain antibodies，HCAbs) ［1］。

随后，研究者同样在软骨鱼类( 如鲨鱼、鳐鱼) 中发现了天然缺失轻链和部分重链恒定区CH1 的重链抗体［2］。

Hamers 实验室还分析鉴别了骆驼血清中重链抗体的结构和序列，发现重链抗体的抗原结合区仅由可变区片段构成，其相当于传统抗体抗原结合片段( Fab) 的功能等同物［1］。

因此，人们把重链抗体的抗原识别区片段称为VHH( variable domain of theheavy chain of heavy-chain antibody，VHH) ，并在此基础上开发出只含有VHH 结构域的单域抗体( singledomain antibody，sdAb，见图1) 。

由于VHH 晶体直径2.5 nm，长4 nm，又被称为纳米抗体( nanobody，Nb) 。

研究者通过免疫骆驼科动物或噬菌体展示技术，筛选并用微生物系统成功表达得到了特异性单域抗体，发现其具备良好的生化特性，包括分子小、水溶性好、稳定性强以及对抗原具备高亲和性等特点［3］，故单域抗体受到了学界和业界的广泛关注。

本文主要对治疗类单域抗体的结构特点及优势、应用方向尤其是产业化情况等进展进行综述。

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1

单域抗体特点

1.1 尺寸小、结构简单且免疫原性低

单域抗体由于缺失轻链和重链恒定区，其分子量约为15 kDa，大小只有几个纳米，是传统抗体单链可变区( single-chain variable fragment，scFv) 片段的一半，而一个完整的传统抗体大小为150 kDa［4］。

研究者通过对单域抗体的序列测序分析和晶体结构研究发现，单域抗体序列结构同人源IgG 抗体的高度可变区( hypervariable region，HVR) 近似，两者均由架构区( framework regions，FRs) 和决定簇互补区域( complementarity-determining regions，CDRs)构成，且均以4 个FRs 形成稳定结构，FRs 测序结果具有80%以上的序列同源性［6］。

不同的是，单域抗体只需3 个CDRs 即可结合抗原，而传统抗体则需6个CDRs 识别抗原［2-6］。

因此，单域抗体不但能够以更小的尺寸、更简单的结构保障抗原的结合活力，自身免疫原性也比较低。

1.2 水溶性高

单域抗体的第二大特点是水溶性高。

这是由于相比传统单链抗体，单域抗体的FR2 框架区域中第37，44，45 和47 位置存在氨基酸突变，这些位置的氨基酸在传统抗体中是疏水性的，突变后成为亲水性氨基酸，从而使单域抗体具有更好的水溶性［6］。

研究数据也表明，通过大肠杆菌表达的单域抗体能在水溶液中保持高浓度，甚至可被浓缩至20 mg·mL^-1而不聚合［7］。

1.3 稳定性强

单域抗体分子内的CDR1 与CDR3 均有一定程度的增长，尤其是CDR3 区域往往具有13 个以上的氨基酸，从而很大程度上弥补了仅3 个CDRs 对抗原的结合稳定性弱的短板。

CDR1 与CDR3 序列中分别普遍存在额外的一对半胱氨酸残基，能在H1及H3 环结构之间形成环间二硫键，使CDR3 形成凸环结构，也让单域抗体与抗原结合更为紧密，更容易插入到抗原的空隙之中［1-6］。

这些结构特点赋予了单域抗体更好的稳定性，相比传统抗体，单域抗体的变性温度往往可以达到60 ℃ ～ 80 ℃，且构象稳定性高［ΔG( H2O) = 30 ～ 60kJ·mol^-1］［4，8］。

2

单域抗体应用优势

2.1 易于生产

由于单域抗体具有结构简单和稳定的特点［3-9］，使其易通过各种体外表达系统进行生产，其中以大肠杆菌或酵母发酵生产较为常见［10-16］。

在大肠杆菌表达系统中，大多以C 端六聚组氨酸( His6) 标记单域抗体，随后通过固定化金属亲和层析( immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC) 提纯。

在酵母表达系统中，毕赤酵母是最常用的酵母表达宿主细胞。

目前实验室条件下，大肠杆菌和酵母表达系统均已实现单域抗体的高产量，产量可大于10 mg·L^-1。

而在大生产中，Ablynx 公司通过毕赤酵母表达系统，已实现产量大于1 g·L^-1的低成本生产［17］。

传统单抗为了保障生产中正确的结构折叠和糖基化等翻译后修饰，较多采用哺乳动物细胞株进行生产，故生产成本高昂，耗时很长，而单域抗体的生产模式能大幅降低成本和提升生产效率。

2.2 易与其他分子偶联

单域抗体分子尺寸在纳米数量级，小于肾过滤的临界值，造成其单体、二聚体、三聚体等分子形式在体内易被快速清除，半衰期较短。

因此，目前开发的单域抗体药物较多采用了多特异性分子联结、结构修饰或者融合蛋白的设计策略来延长体内半衰期，如偶联抗白蛋白结构域、连接血清白蛋白或IgG的Fc 段等，以提高抗体在体内的半衰期; 还能通过多个抗体结构域偶联，靶向多个抗原靶点的同时延长半衰期，提高药效。

此外，另有其他分子偶联策略被用来设计单域抗体药物，如Bagshawe 和Cortez-Retamozo 的研究团队采用了单域抗体-酶偶联的策略，开发抗体导向的酶催化前体药物治疗［18-19］。

该药物由单域抗体和特定催化酶偶联构成，单域抗体负责特异靶向肿瘤抗原，酶负责催化抗肿瘤前药生成毒性药物，从而发挥对肿瘤的靶向杀伤作用。

与抗体偶联药物( antibody-drug conjugate，ADC) 设计类似，单域抗体还可以采用偶联毒素的策略，如偶联肿瘤杀伤性放射性元素或毒性分子，以开发新型单域抗体偶联药物［20-21］。

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2.3 靶向结合胞内靶点

通过细胞内表达单域抗体片段可靶向失活特定的细胞内蛋白、胞内病毒或干扰胞内蛋白间的相互作用［22-25］。

相比传统常用的ScFv 和Fab 形式胞内抗体，单域抗体不但在结构尺寸、免疫原性和稳定性等方面有优势，还可设计靶向细胞内的受体、膜蛋白、转录因子等更多靶点，能针对肿瘤微环境调控的关键通路靶点进行药物开发，如抑制肿瘤特异性表达的转录因子缺氧诱导因子1α( hypoxia induciblefactor-1，HIF-1α) ，能降低肿瘤细胞在低氧或缺氧条件下的活力［22］。

抗病毒方面，靶向人类免疫缺陷病毒1 型( human immunodeficiency virus type 1，HIV-1) 调控蛋白的单域抗体已经显示出抑制病毒活性［23］，其他抗病毒单域抗体也在研究中，如抗乙肝病毒、抗猪繁殖和呼吸综合征病毒( porcine reproductiveand respiratory syndrome，PRRS) ［24-25］。

2.4 能在严酷环境中保持活性

单域抗体不仅尺寸小，还具备优良的热稳定性和化学稳定性，从而大大拓展了药物的开发设计空间。

单域抗体一般要在70 ℃以上的条件下才会发生变性，星鲨来源的单域抗体活性甚至可以在95 ℃和1 h 的条件下仍得以保留［26］。

在化学稳定性方面，单域抗体中的环间二硫键可保护其被蛋白酶水解。研究者针对蛋白酶切割位点的氨基酸序列进行基因重组和二次噬菌体展示，得到的最稳定单域抗体分子可在胃液或肠液培养后仍分别保持41% 和90%的活性［27］。

单域抗体甚至可以在高浓度蛋白变性剂盐酸胍中保持活性［28］。

单域抗体不但具有优异的热和化学稳定性，而且变性后的单域抗体较普通抗体或者单链抗体也更容易复性［29］。

单域抗体的这些特性为多种剂型、多种给药途径( 如口服剂) 治疗用药开发奠定了良好的基础。

3

单域抗体药物研发进展

从第一款单域抗体治疗药物进入临床阶段至今，单域抗体的开发已超10 年，无论是深度还是广度，比利时生物制药公司Ablynx 几乎代表了单域抗体整个领域的发展概况。

其不但自己具备丰富而先进的单域抗体药物研发管线，而且还向包括默沙东、艾伯维在内的诸多大型医药公司转让了众多单域抗体药物项目或与其开展联合开发。

2018 年初法国赛诺菲公司以39 亿欧元收购Ablynx 公司，更是证实了Ablynx 公司在单域抗体技术平台及项目的价值。

根据目前Ablynx 官网披露的消息，Ablynx 已有多达45 项在研项目( 见表1) 。

国内目前除了亿腾医药从Ablynx 引入了2 个项目外，不少药企也在积极开发单域抗体类药物，如深圳国创单域抗体技术公司、苏州康宁杰瑞公司、博生吉医药科技等。

其中，苏州康宁杰瑞公司抗程序性死亡配体( programmed death-ligand 1，PD-L1) 单域抗体药物KN035 正在进行Ⅲ期临床试验，其他公司单域抗体项目均处于临床前阶段。

如前文所述，虽然单域抗体具备上文提到的结构及性能特点和应用优势，但由于其在体内的半衰期较短，故单域抗体药物开发者往往采用了不同的偶联或结构修饰设计策略。本文根据偶联物的种类及用途把单域抗体药物分为3 类，分别介绍当前各类药物典型代表的进展情况。

3.1 多价单域抗体

由于单域抗体所具有的特点，构建多价单域抗体是较为常用的策略，即把针对同一抗原不同表位的单域抗体进行结构域偶联形成多价抗体，相比单价抗体该设计对抗原具有更高的亲和力。

3.1.1 caplacizumab( ALX-0081) 二价单域抗体

caplacizumab( ALX-0081) 是Ablynx 公司研发进度最靠前的单域抗体药物，是抗血管性血友病因子( vonWillebrand factor，vWF) 的二价单域抗体，靶向vWF的A1 结构域以抑制vWF 和血小板间的相互作用，阻断由超大vWF 多聚体介导的血小板相互作用，从而阻止获得性血栓性血小板减少性紫癜( acquiredthrombotic thrombocytopenic purpura，aTTP) 患者形成线状血凝块［30］。

本品的Ⅱ期临床结果显示，该药可缩短40%血小板正常化时间以及减少71% aTTP 复发几率，且接受了caplacizumab 治疗的患者经历过一次或多次严重血栓栓塞、病情加重或死亡的比率只有11. 4%，安慰剂组则达到43. 2%［31-32］。

目前caplacizumab 的Ⅲ期临床试验已完成，结果表明该药能有效降低aTTP相关的主要血栓栓塞性疾病风险及死亡风险［33］，并且caplacizumab 于2018 年9 月获得欧洲药品管理局上市批准，成为全球第一个上市的单域抗体药物和第一个专门用于aTTP 治疗的药物。

3.1.2 ALX-0171 三价特异性单域抗体

呼吸道合胞体病毒( respirtory syncytial virus，RSV) 是一种下呼吸道感染病毒，病毒上的融合蛋白( F-protein) 对其感染靶细胞至关重要。

ALX-0171 是由3 个靶向RSV 融合蛋白的单价单域抗体以甘氨酸-丝氨酸连接而成的三价抗体，通过阻止细胞受纳病毒抑制病毒感染。

而且Ablynx 公司利用纳米抗体优异的理化性能把ALX-0171 开发成了吸入剂型，可直达RSV 感染的气管及肺部。

在对RSV 的A 型和B 型病毒的体外抑制实验中，其活性优于帕利珠单抗( palivizumab，87% vs 18%) ［34］。

在以RSV 感染的刚毛锦鼠模型中，ALX-0171 可降低鼻/肺部病毒滴度及再次感染率，且未发现不良反应和肺部炎症反应［34-35］。

毒性研究发现其对心血管及呼吸道安全，无药理学不良影响［35-37］。

在多个针对成年人的Ⅰ期临床试验以及53 名婴幼儿患者的Ⅰ/Ⅱa 期临床试验中已经被证明，人体对每天重复吸入的ALX-0171 呈现良好耐受性。

同时该Ⅰ/Ⅱa 临床试验结果显示，该药可以快速明显地抑制病毒增殖，显示出令人鼓舞的初期治疗效果。

目前ALX-0171 正在开展Ⅱb 临床试验。

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3.2 半衰期延长型单域抗体

单域抗体药物的半衰期较短问题一直受到业界的广泛关注，其直接影响到药物的治疗效果、给药频率和给药剂量。

单域抗体在多抗体结构域偶联的设计基础上，还可以通过以下策略，进一步提高抗体在体内的半衰期: 

① 设计为多特异性单域抗体，如偶联抗白蛋白结构域形成多特异性单域抗体。

② 进行结构修饰，如聚乙二醇( polyethylene glycol，PEG)修饰。

③ 通过蛋白融合技术，与血清白蛋白或IgG的Fc 段等形成融合分子。

目前在研的大多单域抗体药物，如Ablynx 公司多个产品、苏州康宁杰瑞的KN035 均加入了半衰期延长的设计，其研究数据表明: 

相比传统抗体，半衰期延长型单域抗体具有良好的安全性和有效性，甚至有望成为同类最好的产品。

3.2.1 vobarilizumab( ALX-0061) 二价单域抗体

vobarilizumab( ALX-0061) 是一款靶向白细胞介素6受体( interleukin-6 receptor，IL-6R) 的双特异型单域抗体，其结合了抗IL-6R 和抗白蛋白的2 种结构域，既具有对IL-6R 的高亲和力，同时又延长了抗体的半衰期。

该药已经开展多项临床试验，主要针对类风湿关节炎( rheumatoid arthritis，RA) 和系统性红斑狼疮( systemic lupus erythematosus，SLE) 。

针对RA 的单独用药Ⅱb 期临床研究结果表明其疗效优于同类阳性药物托珠单抗( toclizumab) ; 针对RA 联合甲氨蝶呤( methotrexate，MTX) 用药的Ⅱb 期临床研究显示治疗24 周患者的临床缓解率为51%，但因与对照差别不明显而未能达到主要研究终点。

同时，针对SLE 的Ⅱ期临床也已完成，但结果因未显示出剂量反应而未能达到主要研究终点［38］。

不过，所有临床数据均表明vobarilizumab 具有良好的安全性，说明该药物的设计方案是足够安全的。

3.2.2 ozoralizumab( ATN-103) 和ATN-192 三价双特异性单域抗体

ozoralizumab( ATN-103) 靶向抑制肿瘤坏死因子( tumor necrosis factor，TNF) ，是一种新型的人源化三价双特异性单域抗体，结合了3 个单域抗体结构域，其中2 个抗人TNF 单域抗体，另外一个是抗人血清白蛋白以延长血清半衰期［39-40］。

目前ATN-103 开发进展至Ⅱ期临床阶段，适应证为RA，临床结果达到主要和次要终点且未报道发生任何不良事件，所有患者均存活且RA 患者疾病缓解率为38%［39-44］。

与此同时，Ablynx 在ATN-103 的基础上进行PEG 修饰，研制出了第2 代抗肿瘤坏死因子单域抗体ATN-192。PEG 修饰进一步延长了半衰期，并增强了水溶性和降低了免疫原性。目前也处于临床研究中。

3.2.3 ALX-0761 /M1095 三价双特异性单域抗体

白细胞介素17( Interleukin-17，IL-17) 和辅助性T 细胞17( T helper 17 cells，Th17) 同许多自体免疫病相关，其中白细胞介素17A( Interleukin-17A，IL-17A)和白细胞介素17F( Interleukin-17F，IL-17F) 均是典型的IL-17 家族成员，对Th17 细胞引起的免疫疾病也起到重要作用。

ALX-0761 /M1095 是由Ablynx 开发并授权给Merck 的靶向IL-17A 和IL-17F 的三价双特异性单域抗体药物［45］，其包括抗IL-17A 结构域、抗IL-17F 结构域以及抗人血清白蛋白结构域3个单域抗体，三者偶联以增强靶向性和延长血清内半衰期。

该药已经于2015 年完成了Ⅰb 临床研究，适应证为中度至重度银屑癣。

临床数据显示所有剂量组患者疾病活动度及静态医生评分均有显著改善，而安慰剂组为0%，其中最高剂量组有56% 的患者实现皮肤银屑斑块完全清除。

同时，ALX-0761 具有良好的耐受性和安全性，无任何不良事件报道［46］。该药良好的安全性和有效性预示了其良好的开发前景和市场价值。

3.2.4 KN035 双价单域抗体

国内单域抗体药物研发以苏州康宁杰瑞生物科技有限公司的KN035进度最快，采用了Fc 融合蛋白延长半衰期的策略，其相继在美国和中国取得临床批件，目前正在针对肿瘤开展多项临床试验。

KN035 是一款抗PD-L1 的Fc 融合单域抗体，可激活T 细胞并抑制肿瘤的生长。

相比PD-1，其对PD-L1 具有更强的结合力( 约为1 000 倍) ，且不结合PD-L2［47］。

与人IgG1 Fc 片段融合不但延长了单域抗体的半衰期，还可以增加T 细胞的活化能力。

KN035 还可以常温保存，体外研究表明KN035 的变性温度可达66 ℃左右; 同时该药设计为皮下注射给药途径。

因此，KN035 具有不少新颖的亮点。

临床研究方面，目前该药在中国、美国、日本都有临床试验获批开展，国内进度最快的已经推进到Ⅲ期临床，适应证为不能手术切除或转移性的胆道癌。虽然目前尚未有临床数据披露，但是该药有望在不久获批上市。

3.3 偶联毒素ADC 药物

单域抗体具有体积小、易于偶联的特点，因此，可以与其他化学分子偶联，从而结合抗体的靶向性和化学分子的高效性，为许多疾病治疗提供了新的手段。

如肿瘤治疗方面，单域抗体被设计与毒素分子偶联，开发新型单域抗体ADC 药物。

PG002 是由中国博生吉医药科技公司开发的靶向CD7 的双价单域抗体，并在此基础上将其同假单胞菌外毒素A 偶联，形成的单域抗体ADC 药物，可靶向CD7 阳性白血病细胞并诱导其凋亡［48］。

体外实验数据表明，此ADC 药物可靶向CD7阳性细胞并产生细胞毒性。

药效EC50 值达到23 ～30 nmol·L^-1。

在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷( Non-obese diabetic /severe combined immunodeficient，NOD/SCID) 小鼠移植肿瘤模型中，PG002 可抑制白血病细胞的转移并延长小鼠生存期，且PG002 的有效性非常突出［49］。

目前，该公司正在推进PG002 的人源化及Ⅰ期临床试验申报［48］。

4

结语

传统抗体药物具有分子较大、结构复杂以及较易失活的特点，导致其价格昂贵，并且制约其广泛使用和疗效的发挥。

单域抗体在结构上比传统抗体简单很多，它们能被单基因编码，也更容易用微生物生产，因此生产工艺门槛和成本大大降低。

并且其由于分子小、渗透性强，能够针对传统单抗所不能触及的抗原表位设计药物，能够更好地到达肿瘤内部以及穿透血脑屏障，这大大拓展了单域抗体药物的作用范围，临床价值和市场潜力巨大。

此外，单域抗体药物形式还具有很强的可拓展性，可以相互结合成多价分子、多特异性分子或与其他化合物结合形成药物载体，再加上优异的物理化学稳定性，都给单域抗体带来了巨大的药物开发前景。

单域抗体的小尺寸特性也有不利之处，因其能快速被血液循环排出体外，所以药物清除率过高，体内滞留时间短，不利于药效的持久发挥。

故目前开发的单域抗体药物多通过多分子聚合、偶联或结构修饰的设计以延长半衰期。

这些策略在适当增加了分子大小、延长半衰期的同时，仍然保留了单域抗体的很多优异特性，甚至赋予了更多新的特性。

在产业发展方面，单域抗体从发现到现在还不到30 年时间，目前正处于黄金初始阶段，不乏机遇与挑战。

一方面因为其拥有的诸多优异特性带来的巨大发展潜能，以及传统单抗药物发展进入同质化竞争阶段，单域抗体的差异化竞争优势得以凸显，从而得到资本和产业的青睐。

另一方面，全球第一个单域抗体药物刚刚获批上市，该领域的诸多技术及设计策略尚未接受全面全周期的验证，基础和产业研究的积累还不充分，需要发现和完善的问题尚多，因此单域抗体药物的开发还存在一定的风险挑战。

但相信随着对其了解及改造的深入、开发经验和数据的积累，单域抗体的应用潜能将逐步得到开发并呈现出来，其必将成为一类新兴的抗体药物领域，为许多疾病带来更多更好的解决方案。

参考文献

详见 中国新药杂志 2019 年第28 卷第21 期

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