病理学家经常面临区分高分化肝细胞癌(HCC)与良性肝细胞肿块或结节性病变(如肝细胞腺瘤)以及低分化HCC与非肝细胞肿瘤(如转移性腺癌)的挑战。因此，当遇到疑难病例时，免疫标志物起着不可或缺的作用(表1)。
表 1. 肝细胞肿瘤的诊断标志物
染色模式 | |
肝细胞标记物 | |
pCEA | 管状 |
CD10 | 管状 |
Hep Par 1 | 细胞质 |
Arg-1 | 细胞质和/不包括核染色 |
白蛋白 RNA ISH | 细胞质 |
GPC3 | 细胞质 |
GS | 细胞质 |
HSP70 | 细胞核和细胞质 |
CD34 | 窦状 |
AFP | 细胞质 |
Clusterin | 管状(增强) |
肝细胞标志物
1
CEA 和 CD10
多克隆抗CEA抗体(pCEA)与胆汁糖蛋白发生交叉反应，在正常肝脏中产生特征性小管染色模式。这种小管模式在大多数HCC病例中得以保留，在一些研究中，灵敏度为70%-90%以上。相比之下，腺癌(包括胆管癌)通常表现出弥漫性细胞质染色模式。然而，低分化HCC也可能显示细胞质阳性且缺乏小管免疫反应性，这显着限制了其在区分低分化HCC和腺癌方面的应用。在这方面，使用单克隆抗CEA抗体(mCEA)可能会有所帮助，因为mCEA在腺癌中可能呈阳性，但在HCC中呈阳性的可能性较小。还应注意不要将膜染色解释为肾小管染色，这在腺癌中比较常见。
与pCEA类似，CD10在肿瘤性和非肿瘤性肝组织中也显示管状模式，但与pCEA相比，它对HCC的灵敏度较低。然而，与pCEA不同的是，CD10不太可能显示细胞质阳性，这使得背景更清晰，更容易解读染色结果。
图1. 一例中分化肝细胞癌，显示多克隆癌胚抗原(pCEA;A)，当假腺泡形成时可能显示管腔模式(B;原始放大倍数×400)。
2
肝细胞抗原
肝细胞抗原(Hep Par 1)对肿瘤性和非肿瘤性肝组织进行染色，对HCC的灵敏度超过70%。Hep Par 1阴性HCC往往分化不良。一些阳性病例可能出现斑片状染色，这降低了其对活检标本和细针穿刺的诊断价值。虽然不常见，但一小部分腺癌也可以表达Hep Par 1，当遇到低分化肝内胆管癌或转移性腺癌时，这可能会造成诊断困难。值得注意的是，Hep Par 1抗原也是线粒体中的尿素循环酶氨基甲酰磷酸合成酶。
3
精氨酸酶-1
精氨酸酶-1(Arg-1)也是一种在肿瘤和非肿瘤性肝组织中表达的尿素循环酶。在最初的研究中，Yan等人报告了Arg-1对HCC的灵敏度为96%，即使对于低分化HCC，灵敏度也高达86%。只有罕见的腺癌病例被发现该标志物呈阳性。事实上，随后的研究证实，Arg-1是目前最好的肝细胞标志物，灵敏度约为90%。与Hep Par 1相比，Arg-1在腺癌中的阳性率要低得多。与Hep Par 1一样，Arg-1的阳性染色也可能是斑片状的。
4
白蛋白 RNA ISH
目前尚无白蛋白的诊断免疫标志物。然而，最近的研究表明，白蛋白的支链RNA ISH是一种很有前途的HCC诊断工具，对HCC(包括低分化HCC)的灵敏度为99%。肝内胆管癌是唯一白蛋白阳性且阳性率很高的非HCC癌，但如果Arg-1也纳入检查范围内，则很容易将其与HCC区分开来。除此之外，只有极少数胰腺腺泡细胞癌(包括混合性腺泡导管癌和混合性腺泡神经内分泌癌)显示白蛋白阳性，因此，该测试在区分肝内癌和肝转移癌方面非常有用。值得注意的是，非肿瘤性肝细胞和胆管的白蛋白RNA也呈阳性。
恶性肝细胞标志物
1
甘肽聚糖-3
Glypican-3(GPC3)是一种癌胚蛋白，可在70%至80%的HCC中检测到，但在良性肝细胞病变(如肝细胞腺瘤)中则不能检测到。阳性染色可以是细胞质、膜状、小管状和/或细胞质点状。免疫反应性在肿瘤内通常是异质性的，在高分化HCC中通常是局灶性/斑片状和弱的。研究表明，对于中分化和低分化HCC，GPC3灵敏度可高达80%-90%，但对于高分化HCC的灵敏度可低至50%-67%。因此，可以想象，当GPC3用于区分核心活检中分化良好的HCC和良性肝细胞病变时，这些染色特征具有相当大的影响。事实上，当对活检或细针穿刺标本进行研究时，检出率通常低于50%。另一个缺陷是，在一小部分肝硬化结节中可以检测到局灶性GPC3表达，因此HCC的诊断不应仅基于GPC3阳性。最后，GPC3表达不是HCC特异性的，在许多肿瘤中都有频繁的表达，例如肝母细胞瘤、肝脏未分化胚胎肉瘤、卵黄囊瘤、绒毛膜癌、胰腺腺泡细胞癌、默克尔细胞癌和肺鳞状细胞癌。在一小部分食管、胃、小肠和结肠腺癌中也有染色阳性的报道。GPC3表达仅见于罕见的胆管癌病例，通常为局灶性且弱阳性。事实上，所有已发表的研究都显示胆管癌中GPC3表达呈阴性，只有一项研究在高达13%的病例中显示阳性染色。胰腺导管腺癌也是阴性的，但只对少数病例进行了研究。
2
谷氨酰胺合成酶
在正常肝脏中，谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase,GS)表达仅限于小叶中心(3区)肝细胞，仅在中央静脉周围的一到几个肝板中呈阳性(图2，A)。最近的研究表明，GS是良性和恶性肝细胞肿瘤区分的有效免疫标志物。GS在肝细胞的细胞质中表达强，阳性细胞形成片状，呈吻合地理或“地图状”模式排列，基本上可诊断局灶性结节性增生(FNH)。谷氨酰胺合成酶通常不在含有动脉和胆管的纤维瘢痕周围的肝细胞中表达。这种独特的“地图状”模式几乎见于所有FNH病例，包括形态学上不典型的病例(图2，A)。静脉周围的肝细胞腺瘤呈阴性或阳性，或显示斑片状染色，无明显模式。斑片状染色有时可能与“地图状”染色模式混淆，阳性染色的肝细胞通常存在于腺瘤的外围。此外，染色可能不如FNH那样强烈或均匀。一个例外是β-连环蛋白激活的腺瘤，其通常表现出强烈和弥漫性(定义为>50%的肿瘤细胞阳性染色)GS表达。这可能伴有也可能不伴有核β连环蛋白染色。谷氨酰胺合成酶在70%的HCC病例中呈阳性，但只有约50%的阳性病例表现出强烈的弥漫性染色模式(图2，B)。尽管人们普遍认为GS表达的上调是β连环蛋白核易位的结果，但在超过3%的肝细胞腺瘤和HCC中，强和弥漫性GS免疫染色与β连环蛋白外显子50突变之间缺乏直接相关性。谷氨酰胺合成酶似乎不是区分肝细胞和非肝细胞肿瘤的良好标志物，因为它的表达已被证明见于76%的肝内胆管癌和71%的肝转移性肿瘤，以及100%的胰腺实性假状肿瘤。
图2.谷氨酰胺合成酶的免疫染色表明肝核心活检显示局灶性结节性增生的特征性“地图状”染色模式(A)。正常肝脏仅在中央静脉周围的一到几层肝细胞中显示出免疫反应阳性。弥漫性强细胞质染色通常见于肝细胞癌(B)，以及肝细胞腺瘤的一个亚群(原始放大倍数×20[A]和×200[B])。
3
热休克蛋白70
在一项基因表达谱研究中，热休克蛋白70(HSP70)是早期HCC中上调最丰富的基因。据报道，70%的HCC存在核和细胞质HSP70免疫反应阳性(图3，A)，它通常呈斑片状，具有中等染色强度。弥漫性阳性仅见于三分之一的病例，活检标本的阳性率低于50%。HCC中HSP70的表达似乎与肿瘤分化无关，它通常在胆道上皮细胞中表达，可用作内部对照。根据经验，HSP70是一种不太理想的标志物，不仅因为它对活检的灵敏度低，而且解释困难。因为良性肝细胞，尤其是肝硬化结节中的肝细胞，在某些情况下也可以被阳性染色(图3，B)。因此，与非肿瘤性肝细胞相比，如果它们也存在于同一活检中，则需要更强的染色。与GS类似，HSP70经常在胆管癌(88%)和转移性肿瘤(如CRCs)中表达，这限制了其在区分肝细胞和非肝细胞肿瘤方面的实用性。
图3.在高分化肝细胞癌病例中可见核和细胞质HSP70免疫染色阳性(A)。在肝硬化结节的肝细胞中也观察到阳性染色(B)，如果两种成分都存在于同一活检中，则与肝细胞癌相比，染色可能较弱。注意良性胆管和胆管的免疫反应阳性结果更强(原始放大倍数×400)。
4
CD34
CD34具有诊断作用，因为它在肿瘤性和非肿瘤性肝组织中显示出不同的染色模式。在正常和肝硬化肝脏中，它会染色门静脉束和纤维隔膜血管内衬的内皮细胞，鼻窦间隙大部分为阴性，但紧邻门静脉束或纤维隔的间隙可能显示阳性染色(图4，A)。相比之下，弥漫性窦状染色模式是HCC的特征(图4，B)，见于95%的病例。肝细胞腺瘤主要表现为斑片状窦状染色(图4，C)，但在约20%的病例中可见弥漫性染色。在FNH中，肝周围加重的斑片状染色也很常见。
图4.在非肿瘤性肝脏中，CD34可突出显示紧邻门静脉的门静脉血管和窦状结构(A)，但在肝细胞癌中，由于与肝肿瘤发生相关的毛细血管化，CD34可显示弥漫性(也称为"完全")窦状结构染色模式(B)，或在大多数肝细胞腺瘤中显示斑片状(也称为"不完全")窦状结构染色模式(C)(原始放大倍数×400[A和B]和×200[C])。
5
α-胚蛋白
尽管肝细胞癌患者的血清α-胚蛋白(AFP)水平经常升高，但其组织切片检出率仅为30%左右。AFP在肝母细胞瘤和卵黄囊肿瘤中常呈阳性。而在胆管癌和肝转移癌中并不常见，这已被大量文献充分证明。
6
聚类蛋白
聚类蛋白(Clusterin)是一种多功能糖蛋白，与许多生物学过程有关，例如程序性细胞死亡、脂质转运、细胞粘附、膜循环、补体调节、衰老、肿瘤发生和癌症化疗耐药性。一些研究表明，在54%至75%的HCC中，存在管状Clusterin染色模式。在HCC病例中，假腺泡的管腔表面也观察到Clusterin的强表达。这种管状模式似乎是HCC所特有的，因为与良性肝细胞结节病变(如肝细胞腺瘤、FNH和大再生结节)相比，HCC的管状模式明显增强(图5，A)，并且在迄今为止检查的非肝细胞肿瘤中也未观察到这种染色模式。细胞质免疫反应见于恶性和良性肝细胞，良性肝细胞也可能显示管状染色，但它总是细小的、颗粒状的，并具有类似“铁轨”的模式(图5，B)。Clusterin优于pCEA和CD10，因为它不仅有助于区分肝细胞和非肝细胞起源，还有助于区分恶性肝细胞结节性病变和良性肝细胞结节病变。与高分化或中分化HCC相比，在低分化HCC中观察到增强的管状染色模式较少见。
图5.Clusterin在肝细胞癌(A)中显示增强的管状染色模式，但在邻近的非肿瘤性(硬化性)肝脏(B)中显示细小的颗粒状管状染色模式。注意在恶性和良性肝细胞中均可见细胞质染色(原始放大倍数×400)。
与传统 HCC 相比，纤维层状变异型通常AFP 阴性，GPC3 阳性率较低，而CK7阳性率高。一项研究显示，24名患者的33个纤维层状样本中有31个(97%)表达CD68，而非肝硬化患者39份传统 HCC 样本中有10份(27%)表达 CD68，肝硬化患者的27份HCC样本中有3份(11%)表达CD68。染色为细胞质染色，通常具有颗粒状或斑点状。该标志物可能有助于将纤维层状HCC与硬化型 HCC 区分开来，而硬化型 HCC 可能会在中心区域活检中造成诊断上的混淆。
分子研究的进展已将肝细胞腺瘤细分为4种不同的类型：HNF1α灭活、β-catenin激活、炎症和未分类型。简而言之，HNF1α灭活腺瘤的特征是组织学上呈弥漫性脂肪变性、编码肝细胞核因子-1α的HNF1α基因发生体细胞或种系突变，免疫组化显示显示肝脂肪酸结合蛋白表达缺失。β-Catenin激活变体经常出现核不典型性，并携带CTNNB1基因突变。从免疫表型上看，这种变异型表现出强烈而弥漫的GS表达，伴有或不伴有核β-catenin染色。鉴别这种变异型非常重要，因为它与HCC的发生密切相关。炎性腺瘤以前被称为"毛细血管扩张性FNH"。其特征是局灶性或弥漫性炎性细胞浸润、窦道扩张和导管反应。大约80%的炎性腺瘤有IL6ST、JAK1、STAT3、FRK或GNAS基因突变。多达10%的病例还同时伴有CTNNB1基因突变。该变异型的诊断免疫标志物是血清淀粉样蛋白A和/或C反应蛋白，它们通常显示弥漫性胞质免疫反应。邻近的非肿瘤性肝细胞也可能显示这两种标记物的阳性染色，但染色通常是斑片状的，强度较低。
炎性肝细胞腺瘤与FNH的区别
如上所述，炎性腺瘤中可能存在导管反应，在核心活检中可能与FNH混淆。如图6 A所示，GS显示出FNH特有的"地图状"模式。与此相反，腺瘤要么阴性，要么在静脉周围阳性，要么显示斑块状染色，没有明显的模式。在伴有CTNNB1突变的炎性腺瘤中，可能会出现强烈的弥漫性GS染色，并伴有或不伴有核β-catenin定位。血清淀粉样蛋白A在腺瘤中呈阳性，但在FNH中通常呈阴性。一项研究显示，78%的FNH呈阳性，15%呈弥漫性染色。这项研究还显示，40例FNH中有7例血清淀粉样蛋白A呈阳性染色，其中5例呈弥漫性染色。因此，"地图状"GS模式最有助于鉴别。
高分化HCC与肝细胞腺瘤的区别
在组织学上区分HCC和肝细胞腺瘤是众所周知的诊断难题。尤其是当HCC分化良好且诊断材料有限(如核心活检)时。除网状蛋白染色外，许一些免疫标记物也被证明具有帮助鉴别的价值(表2)。其中，GPC3得到了更好的研究，在腺瘤中从未发现它是阳性的。据报道，HSP70在腺瘤中呈阴性，尽管GPC3和HSP70在核心活检中检测HCC的灵敏度较低，但鉴于其高度特异性，有助于区分HCC和肝细胞腺瘤。CD34和Clusterin的独特染色模式也可能有用。其他免疫标志物，如增殖细胞核抗原和胰岛素样生长因子2，也有助于鉴别诊断，但需要同时存在肿瘤性和非肿瘤性肝细胞才能对其进行解释。谷氨酰胺合成酶似乎不是这种区别的良好标志物，因为在HCC和腺瘤中都可以看到强烈和弥漫性染色模式。
表2.用于区分高分化肝细胞癌(WDHCC)与肝细胞腺瘤(HCA)和高级别异型增生结节(HGDN)的免疫标志物
标志物 | WDHCC,% | HCA,% | HGDN,% |
GPC3 | 50-69 | 0 | <10 |
GS | 35-60 | 10-15 | <15 |
HSP70 | 40-78 | 0 | <10 |
3个标志物中至少2个阳性 | 50-72 | 0 | 0 |
CD34 | 95 | 20 | +/- |
Clusterin | 75 | 0 | - |
CK7 | 边界浸润性 | - | 边界无浸润 |
早期肝细胞癌和发育不良结节的区别
发育不良结节(DN)被认为是HCC的前体病变。这些结节性病变通常在肝硬化中检测到，大小通常约为1 cm，在颜色和/或质地方面与周围的肝硬化结节截然不同。高级别DN(HGDN)至少有中度细胞学或结构不典型性，但这些异常不足以诊断为HCC。因此，在组织学上区分HGDN与早期HCC具有挑战性。CK7是有用的免疫标志物之一，它有助于突出早期HCC的基质侵犯区域，因为肿瘤边界没有导管反应。相反，由于HGDN缺乏侵袭性生长，其周围会出现导管反应。
有研究者比较了22例HGDN与32例早期或高分化HCC，发现分别有69%、59%和78%的HCC中表达GPC3、GS和HSP70，而HGDN的表达率分别为9%、14%和5%。这些标记物在HGDNs中的表达为局灶性(<50%的细胞呈阳性)。高达72%的HCC病例显示这三种标记物中至少两种呈阳性。因此，建议将这3种标记物作为一个套餐使用，因为如果肝脏病变中有2种标记物呈阳性，则对HCC的特异性非常高(100%)。
CD34免疫染色在区分早期HCC和HGDN中的价值已在一些早期研究中进行了研究。156-158因此，DN可能表现出弥漫性窦状模式，尽管频率低于HCC。另一方面，早期HCC可能表现出斑片状模式，因为它们仍处于癌变的早期阶段
肝样癌和肝细胞癌的区别
肝样癌是一种独特的肝外腺癌，肿瘤的重要组成部分或整个肿瘤显示肝细胞分化。它可以起源于各种器官，如胃、胰腺、胆囊、食道和结肠。与HCC相比，肝样癌的免疫组化结果中AFP阳性率更高(92%)(这些患者大多血清AFP水平升高)，CK19阳性率更高(100%)，而Hep Par 1阳性率较低(38%)。三分之二的病例可见管状pCEA和CD10染色。值得注意的是，分别只有约30%和约10%的HCC对AE1/AE3和CK19呈阳性，而CK19的表达被视为HCC患者预后不良的预测标志物。肝癌还可能表达MOC31和mCEA，而这两种物质在HCC中很少表达。
在最近一项针对8种肝样癌的研究中，结果显示，8例(100%)、5例(62.5%)、4例(50%)和4例(50%)分别出现Hep Par 1、Arg-1、GPC3和AFP阳性染色。3例(37.5%)观察到管状pCEA模式。对4个病例进行了白蛋白ISH检测，其中3个病例(75%)呈阳性。这些的研究结果表明，肝样癌不仅在组织学上，而且在免疫表型上与HCC基本上没有区别，只有靠免疫表型的显色位置才能可靠区分。
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文献来源：
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