作者：潜水
最近，一位肺癌病友告诉笔者，自己做了两次穿刺组织基因检测，都没有任何突变。而手术后坚持又检测一次，才测出了ROS1阳性。前两次的检测结果难道是假的吗？
笔者了解到，这样的例子不在少数。绝大多数女性腺癌患者，尤其是年轻女性，都有驱动基因突变，必须要重复检测。难以检测的原因未必是肿瘤异质性，融合基因本身就相对难测一些。
在医学检验领域，对于ROS1基因融合的肺癌，用FISH检验是金标准，同时RNA也可以达到同样的效果。但传统的DNA下一代测序技术(Next-Generation Sequencing，NGS)，在效果上就要差一些。当癌症涉及到ROS1、ALK、MET等基因突变和融合时，NGS存在着假阴性率较高的问题。此外，也有研究显示，当患者的DNA测序没有明显异常时，补充RNA测序有可能检测到MET 14外显子跳跃突变或其他基因融合。
RNA-seq，即转录组测序技术，就是用高通量测序技术进行测序分析，反映出mRNA、small RNA、noncoding RNA等表达水平。随着下一代测序技术的发展，RNA-Seq技术应用范围变得更加广泛，并逐渐应用于肿瘤患者的突变基因检测。
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RNA测序的优势
以肺癌为例。肺癌是靶点及靶向药种类最多的癌症，肺癌8基因panel（包括EGFR, KRAS, ALK1, BRAF, ROS1, RET, MET和ERBB2）是目前几个国际指南联合推荐的。然而, 这些基因突变的总和占到肺癌总病例数的45-50%左右，仍然有50%或者更多的病人无法找到靶点，进而得到相应的靶向治疗。
美国纪念斯隆凯特琳癌症中心分子病理的专家团队评估了靶向 DNA 测序 (DNAseq) 驱动基因变异阴性的肺癌中，RNA 测序 (RNAseq) 在鉴定基因融合和 MET 基因14号外显子(METex14)跳跃突变中的显著优势。该团队先使用获得FDA批准的DNA靶向测序MSK-IMPACT，涵盖400-468个基因的所有外显子及部分基因的内含子区域，对2522例肺癌进行了DNA层面的变异检测。
驱动基因突变阴性的肺癌再使用定制的 RNAseq (MSK-Fusion) 做进一步分析。DNA测序检出了 195 例（7.7%）融合和 119 例（4.7%）MET 14号外显子变异， 占所有肺癌标本的12.5%。
在254例驱动基因检测阴性、且有足够材料用于 RNAseq测试的病例中，14% (36/254) 的病例有新的发现，其中 33 例适用靶向治疗（27 例融合，6 例 MET 14号外显子跳跃突变）。
33 名患者中有10 名随后接受了匹配的靶向治疗，其中 8 名（80%）显示出临床获益。另外，这一研究还发现，肿瘤突变负荷（TMB）低的肺癌明显比TMB高的肺癌有更高的融合阳性率 （31% vs. 7%）。
因此，如果肺癌患者在DNA检测层面缺乏驱动基因突变时，应该考虑进行RNAseq检测。
RNA测序可检出更多
MET 14外显子跳跃突变患者
MET 14外显子发生的突变大部分位于外显子起始端或末端和内含子交接处，突变分布的区域较广泛，而以DNA为基础的NGS探针所需覆盖的区域广泛，一旦不能全面覆盖这些突变的区域，可能会造成漏检，TCGA数据库的分析基于DNA的NGS只能检测约80%的MET 14外显子跳跃突变。
而在RNA层面上，MET 14号外显子发生的突变会直接导致整个14号外显子的缺失，故只要检测到MET 13号外显子后面接的15号外显子，就能说明存在14号外显子的突变，探针覆盖区域小，不容易产生漏检。
2020年，ASCO上公布了哥伦比亚医学中心的Magdalena等人的一项研究，研究比较了DNA检测与RNA检测对MET 14外显子跳跃突变的检出率。对644例肺腺癌患者进行以DNA为基础的NGS检测时，共检测到16例MET 14外显子跳跃突变的病例（2.5%），而当使用以RNA为基础的NGS技术对剩下的DNA检测阴性样本作进一步检测，又发现了另外9例MET 14外显子跳跃突变。
图 1 Magdalena论文首页
图 2 MET 14外显子跳跃突变的分子机制
(图源Efficacy of DNA versus RNA NGS-based Methods in MET Exon 14 skipping mutation detection.)
Kurtis等人分别采用基于DNA的NGS技术（DNA-seq）和基于RNA的NGS技术（RNA-seq）对肿瘤组织进行测序。结果DNA-seq在856个非小细胞肺癌样本中检出11个（1.3％）样本存在MET 14外显子跳跃突变，而RNA-seq在404个样本中检出17个（4.2％）样本存在MET 14外显子跳跃突变，与DNA-seq相比，检出率显著增加。而进行DNA-seq和RNA-seq联合检测的286个样本中检出10个样本存在MET 14外显子跳跃突变，其中6个样本DNA-seq无法检出，提示DNA-seq容易漏检MET 14外显子跳跃突变。
图 3 DNA与RNA测序对比
（图源DNA-Based versus RNA-Based Detection of MET Exon 14 Skipping Events in Lung Cancer.）
RNA测序更适合同时检测多种基因融合
非小细胞肺癌最多见的致病性基因融合为ALK融合，但随着研究进展，发现了越来越多的致病性基因融合，包括ROS1、RET、NTRK、NRG1等，这些基因融合均为可靶向治疗的基因异常。
传统检测基因融合的技术方法如FISH、RT-PCR等，这些方法灵敏度高，但通常只检测单个融合基因的存在，诊断过程漫长、需要的样本多，且费用昂贵。此外，这些方法不能识别新的融合基因伴侣或解决复杂的结构重排，这也是导致假阴性结果的主要原因。而基于DNA的NGS技术可以实现一次性检测多种基因融合，但准确度较低，而结合基于RNA的NGS技术则可以提高准确度。
2020年，Ryma Benayed等人的研究发现DNA-seq结果阴性的患者进行RNA-seq可以检出有可靶向治疗的基因融合和MET 14外显子变异。研究人员先对2,522例肺腺癌进行DNA-seq，结果检出195例（7.7%）基因融合，119例（4.7%）MET 14外显子变异。
图 4 RNAseq融合阳性/DNAseq阴性的肿瘤患者的临床结果
（图源High Yield of RNA Sequencing for Targetable Kinase Fusions in Lung Adenocarcinomas with No Mitogenic Driver Alteration Detected by DNA Sequencing and Low Tumor Mutation Burden）
而在DNA-seq结果阴性的患者中有254例有足够样本进行RNA-seq，结果有14%（36/254）病例检出基因异常，其中33例为可靶向治疗的基因异常，包括MET 14外显子跳跃突变6例、ROS1融合10例、NRG1融合5例、ALK融合4例、RET融合3例、NTRK3融合2例、BRAF融合1例、FGFR2融合1例、NTRK2融合1例。这33例患者中有10例接受了相应的靶向治疗，结果8例有临床获益。
32%（81/254）的DNA-seq阴性病例为低TMB（0-5mut/Mb），这些低TMB病例RNA-seq结果为31%（25例）存在基因融合，而在TMB>5 mut/Mb的DNA-seq阴性病例中进行RNA-seq，结果仅7%存在基因融合，差异有统计学意义。研究结果提示低TMB的DNA-seq阴性患者中有更多漏检的基因融合患者。
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研究案例
2020年，九江市第三人民医院肿瘤科疏云主任团队与和瑞基因合作的研究成果《Identification of a Novel MPRIP-ROS1 Fusion and Clinical Efficacy of Crizotinib in an Advanced Lung Adenocarcinoma Patient: A Case Report》发表在《OncoTargets and Therapy》（IF=3.337）杂志上。
该研究报道了一例晚期肺腺癌患者通过和瑞基因针对RNA水平的融合基因检测Panel发现一种新的ROS1基因融合现象——MPRIP-ROS1，接受酪氨酸激酶抑制剂-克唑替尼治疗后，影像学显示原发灶完全缓解，多处骨转移灶显著缩小，无进展生存超过18个月，目前仍然在随访中。
患者为45岁中国女性，无吸烟史和癌症家族史，于2019年3月因咳嗽并伴有白粘痰入院就诊。胸部CT显示左肺上叶不规则肿块并伴随多处淋巴结肿大。99mTc-MDP全身骨影像显示全身多发性转移性骨损害。结合肺部活检综合诊断为IVA期肺腺癌。
图5 临床治疗过程和影像学特征
为寻求适合患者的临床治疗方案，对患者样本进行了和瑞基因NGS检测，基于RNA fusion panel检测发现ROS1基因35外显子与MPRIP基因21外显子发生了罕见的重排。这是迄今为止发现的首例MPRIP-ROS1融合现象，并通过RT-PCR和Sanger测序验证了融合断点。
鉴定和验证一种新型基因融合MPRIP-ROS1
患者使用克唑替尼治疗2个月，胸部CT显示左肺上叶肿块和纵隔淋巴结基本消失(Fig. 1C and 1F)，患者实现完全缓解（CR）。克唑替尼治疗9个月后，左肺上叶未见明显肿块，纵膈未见明显肿大淋巴结(Fig. 1D and 1G)，全身骨影像显示多处骨转移病灶浓聚明显减淡并减少 (Fig. 1I) 。截至2020年10月，患者病情稳定，达到至少18个月的无进展生存期（PFS），并持续随访中。
该研究通过基于RNA的NGS检测在伴随多处骨转移的晚期肺腺癌患者样本中发现了新的融合变异MPRIP-ROS1，经克唑替尼单药治疗后，原发灶和转移灶均表现出持续缓解；提示DNA NGS法结合基于RNA的NGS检测有助于提高融合变异的检出率，增加患者接受靶向治疗的获益机会。
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关于基因融合的检测
NCCN指南在分子和标志物检测原则中指出，当患者经过广泛检测，未发现驱动基因突变时，推荐基于RNA的NGS检测方法来排除基因融合。所以，DNA+RNA NGS法检测基因融合是权威指南的推荐检测模式。
此外，2019年发表在CCR的文章《Wake up and smell the fusions: Single modality molecular testing misses drivers》，提到了DNA检测的弊端：
①内含子序列较长（如NTRK3、NRG1），探针难以全面覆盖；
②内含子区域存在重复序列（如ROS1 intron31），探针设计难度高，生信算法难度高，测序数据难以比对；
③肿瘤细胞占比低，突变丰度低于检测下限，无法检出；
④特定内含子低质量测序和复杂重排形式，无法捕获序列信息。
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DNA/RNA同时测序，未来可期
目前NCCN指南建议，当使用NGS技术进行几百个基因的检测，仍然没有异常时，建议补充基于RNA的NGS，以排除漏检的情况。国内的NGS产品也有一些是包含了RNA-seq，当然不同的产品RNA-seq涵盖的基因数量不一样，价格也不一样。NGS在技术上进行RNA测序是没问题的，但是阻碍RNA-seq更多的是因为分别进行两次检测会增加费用和时间。
2019年MSKCC发表在CCR的研究则从临床实际应用角度进行了回答。研究对254例DNA-NGS检测驱动基因阴性且具有足够样本的患者再次进行靶向RNAseq panel测序，有13% (33/254)的患者检出了靶向药相关的融合突变，其中10例患者接受相匹配的靶向治疗，跟踪随访显示，80%的患者出现不同程度的临床获益。
所以从临床研究来看，综合DNA+RNA双维度共检基因融合，可以更大程度地发现融合事件，使更多患者从靶向治疗中获益。
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