【摘要】目的本文探讨我区防风固沙植物黑沙蒿（鄂尔多斯蒿）在抗菌、抗炎、抗糖尿病方面的药用价值。方法超声提取法制备黑沙蒿根、茎、叶的不同溶剂提取物或萃取物，对倍稀释法测定各提取物及萃取物对实验菌株（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA）的最低抑菌浓度(MinimumInhibitory Concentration, MIC)，采用小鼠耳肿胀模型测定根95%乙醇提取物及萃取物对小鼠耳肿胀的抑制活性，以过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ, PPAR-γ）激动剂罗格列酮为阳性对照，采用分子对接手段对黑沙蒿中黄酮类化合物与PPAR-γ进行对接。结果黑沙蒿根、茎、叶的不同极性提取物及萃取物对实验菌株有不同程度的抑制作用，以茎的乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强（MIC=1.25 mg/mL），根95%乙醇提取物的正丁醇萃取物对大肠杆菌抑制活性最强（MIC=15.00 mg/mL），乙酸乙酯和正丁醇萃取物对MRSA抑制活性相同（MIC=7.50 mg/mL）。根95%乙醇提取物（100.00mg/kg）对小鼠耳肿胀抑制活性优于阳性对照地塞米松（191.91mg/kg），二者无显著性差异（P>0.05），乙酸乙酯萃取物（100.00mg/kg）对小鼠耳肿胀抑制活性最强。黄酮类化合物与PPAR-γ呈现了较好的对接亲和力，但低于罗格列酮（-8.7kcal/mol），以5,3′,4′-三羟基-7-甲氧基黄酮为最好（-8.3kcal/mol），黄酮类化合物A环与B环上的氧原子易与PPAR-γLBD形成1个（Tyr327）或2个（Tyr327、Arg288）关键氢键。结论黑沙蒿根具有明显的抗菌、抗炎作用，其中黄酮类化合物可能通PPAR-γ介导的生理路径产生抗糖尿病活性，具有重要的药用开发价值。
【关键词】黑沙蒿；抗菌；抗炎；分子对接；黄酮
黑沙蒿（ArtemisiaordosicaKrasch.）为菊科蒿属植物，又名鄂尔多斯蒿、油蒿、籽蒿、哈拉-啥巴嘎（蒙语），主要分布于我国北部、西北部，防风固沙性能良好，为西北地区代表性植被，近年大面积飞机播种使其资源分布更加广泛[1-2]。
黑沙蒿味辛苦，性微温，全草均可入药。《中华本草》记载其可祛风除湿、解毒消肿，主治风湿性关节炎、感冒头痛、咽喉肿痛、痈肿疮疖；蒙医作消炎、止血、祛风、清热药[3]。《中国沙漠地区药用植物》记载，其可治鼻出血：鲜根，去外皮，折断用鼻嗅之（如嗅之过久，能引起鼻腔肿胀）；休克晕倒用鲜根闻之即能苏醒。《内蒙古中草药》记载其具有止血及治鼻衄、吐血、功能性子宫出血的功效。黑沙蒿中化学成分主要包括黄酮类和萜类（主要为萜烯），以及甾醇类、香豆素类、有机酸类、多糖类、氨基酸类及微量元素等[4-6]。
随着抗生素的滥用，细菌耐药性和抗药性逐渐增加。抗生素的临床应用受到限制，同时也为治疗感染的中成药新药研发提供了更大的发展机会。本实验研究黑沙蒿提取物对常见致病菌的抑制作用，通过小鼠耳肿胀模型初步考察黑沙蒿根的抗炎作用。PPAR-γ核受体主要表达于脂肪组织及免疫系统，与脂肪细胞分化、机体免疫及胰岛素抵抗关系密切，成为研究热点[7]。PPAR-γ配基包括生理性配基和药理性配基，Lehmann等报道非甾体类抗炎药吲哚美辛能与PPAR-γ结合并使之活化[8]，Rime等利用分子对接手段从天然产物数据库中筛选得到7个黄酮和异黄酮类PPAR-γ激动剂[9]。前期研究发现黑沙蒿含有18种黄酮类化学成分[10]，本文从中筛选PPAR-γ激动活性成分，旨在从分子水平阐释黑沙蒿PPAR-γ激动作用的潜在药效物质基础。通过以上研究为进一步开发利用黑沙蒿提供科学依据。
1 实验材料
1.1药材
黑沙蒿，于2014年10月采自鄂尔多斯市康巴什区，经鉴定为鄂尔多斯蒿。
1.2 活性研究
供试菌种金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、大肠杆菌（ATCC 25922）、MRSA由鄂尔多斯市中心医院检验科惠赠；营养肉汤（杭州微生物试剂有限公司生产，批号130509）；血琼脂平板（天津金章科技发展有限公司，批号130530）。
体重20±2g 昆明种小鼠（内蒙古大学实验动物中心）；醋酸地塞米松片（天津力生制药股份有限公司，20150104）；二甲苯（天津市风船化学试剂科技有限公司，20140620）。
PPAR-γ蛋白X-ray晶体三维结构文件（来源于RCSB 蛋白数据库，http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do, PDB code: 2PRG）[10]，计算机辅助药物设计专用电脑（Think Station P300工作站）。
2 实验方法
2. 1不同极性提取物的制备
分别称取1份（6g）干燥粉碎的黑沙蒿根、茎、叶，分别加入甲醇、95%乙醇和乙酸乙酯各100mL，超声提取4次，每次0.5 h。合并提取液，母液浓缩干燥，分别得到甲醇提取物、95%乙醇提取物和乙酸乙酯提取物；另外称取1份黑沙蒿根（6g），加95%乙醇100mL，超声提取4次，每次0.5 h，合并提取液，回收乙醇，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物及水溶物。
2. 2 抗菌活性研究
肉汤培养基经高压灭菌（121℃，15 Pa）15 min 后，冷却至60℃时倒入培养皿中，制备平板培养基，备用。将供试菌株分别接种于血平板上，置35℃恒温培养箱培养24 h 活化，待用。挑取血平板上形态相同的菌落，用灭菌生理盐水校正菌液浓度，再用营养肉汤稀释至含菌量约107CFU/mL。稀释后的菌液在15 min 内接种，备用。
黑沙蒿提取物用生理盐水溶解，加入适量吐温-80增强溶解度。取0.1mL溶解后的样品用1mL营养肉汤溶解、过滤、除菌。随后对倍稀释至第6管，并分别命名，第7管作为阴性对照，第8管作为空白对照。随后用营养肉汤制备0.5McF的菌悬液，以1:200稀释。向1-7号管内分别加入0.05mL的菌悬液，混合均匀，所有试管放入35 ℃恒温培养箱中培养20 h，取出，观察生长情况。在对照管符合要求的情况下，以肉眼未见生长的最低药物浓度（mg/mL）为细菌的MIC。
2. 3抗炎活性研究
昆明种小鼠70只，雌雄各半，随机分为7组，每组10只。空白对照组（CMC6.6mL/kg）、阳性对照组（醋酸地塞米松191.91mg/kg）、总提取物组（95%乙醇提取物100.00mg/kg）、石油醚萃取物组（100.00mg/kg）、乙酸乙酯萃取物组（100.00mg/kg）、正丁醇萃取物组（100.00mg/kg）、水萃取物组（100.00mg/kg）连续灌胃给药5天，末次给药0.5h后，将二甲苯（0.1mL/只）均匀涂抹在小鼠右耳的背腹两面，1h后脱颈处死小鼠，在双耳同一位置用直径6mm打孔器打出圆形耳片，精密称重，计算小鼠耳片肿胀度及抑制率。
耳片肿胀度计算公式：肿胀度=致炎侧耳片重量（右耳）－对照侧耳片重量（左耳）
肿胀抑制率计算公式：抑制率=（对照组肿胀度－给药组肿胀度）/对照组肿胀度×100%
2. 4黑沙蒿中黄酮类化合物与PPAR-γ靶点的分子对接研究
PPAR-γ与配体小分子共结晶（PDBcode:2PRG）从RCSB 蛋白数据库下载。晶体结构预处理采用分子建模软件包Chimera 1.5.3（National Institutes of Health, Bethesda,MD, USA）[11]。A链或B链从2PRG中分离，去除C链及所有配体和水分子（关键水分子除外），计算蛋白质质子化态，备用。受体加氢及gridbox设置采用分子建模软件包MGLTools 1.5.4（The Scripps Research Institute, La Jolla,CA, USA）处理[12-13]。
化合物平面结构用ChemDraw 软件绘制，通过Chem3D Ultra 8.0（CambridgeSoftCorporation, Cambridge, MA, USA）转换成三维结构并能量最小化，加载电荷，备用。分子对接采用软件AutoDock Vina 1.1.2的默认设置和计分函数（The ScrippsResearch Institute, La Jolla, CA, USA）[14]。PyMOL v1.5用于分析和观察配体-蛋白质的对接构象（SchrodingerLLC, New York, NY, USA）。
3 实验结果
3. 1抗菌活性研究
Table 1. 黑沙蒿根、茎、叶的提取物的提取率及对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的最低抑制浓度（MIC, mg/mL）
Extraction
rate
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Crude extracts
root
stem
leaf
root
stem
leaf
Methanol
9.17 %
30.78
10.34
30.50
30.14
22.01
36.42
95% Ethanol
10.5 %
60.00
3.75
7.50
37.50
71.67
19.47
Ethyl estate
0.32 %
2.50
1.25
7.50
42.66
78.34
59.16
由表1可知，黑沙蒿根、茎、叶的不同极性提取物对实验菌株均有不同程度的抑制作用，其中以茎的乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强（MIC=1.25 mg/mL），叶的95%乙醇提取液对大肠杆菌的抑制活性最好（MIC=19.47 mg/mL）。
Table 2. 黑沙蒿根95%乙醇提取物的萃取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和MASA的最低抑制浓度（MIC, mg/mL）
Fractions
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
MRSA
Petroleum ether
19.40
24.67
11.79
Ethyl estate
3.75
30.00
7.50
n-Butanol
75.00
15.00
7.50
Water
30.00
>140.10
15.00
由表2可知，黑沙蒿根95%乙醇提取物的萃取物中以乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌抑制活性最好（MIC=3.75 mg/mL），正丁醇萃取物对大肠杆菌抑制活性最好（MIC=15.00 mg/mL），二者对MRSA抑制活性相同（MIC=7.50 mg/mL）。
3.2抗炎活性研究
Table 3. 二甲苯致小鼠耳肿胀实验结果(x±S，n=10)
组别
剂量/(mg/kg)
肿胀度(mg)
肿胀抑制率(%)
模型组
-
7.15±2.12
-
阳性组
192.21
1.53±1.47*
78.62
石油醚组
100.00
5.64±1.42
21.18
乙酸乙酯组
100.00
0.69±0.45*
90.37
正丁醇组
100.00
5.19±2.15
27.42
水提物组
100.00
5.18±2.42
27.64
总提物组
100.00
2.19±1.17*
69.31
注：与模型组比较，*P<0.05.
由表3可知，黑沙蒿根95%乙醇总提取物的乙酸乙酯萃取物组小鼠的耳肿胀度比模型组小（P<0.05），肿胀抑制率高于总提取物组醋酸地塞米松组；总提取物组小鼠的耳肿胀度比模型组小（P<0.05），肿胀抑制率高于醋酸地塞米松组，说明黑沙蒿根95%乙醇提取物及黑沙蒿根95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物抗小鼠的耳肿胀效果很强。
3. 3黑沙蒿中黄酮类化合物基于PPAR-γ靶点的分子对接研究结果
PPAR-γ配体结合域（ligand binding domain, LBD）可容许不同配体进入并形成适当构象从而组成配体-受体复合物[15]。晶体结构2PRG包含了不对称分子单元A和B。分子再对接发现只有A链给出了所有关键的配体-受体氢键组合，同时，A链被认为与激活态的PPAR-γ蛋白结构相近[16]。因此，A链被用于PPAR-γ激动剂的分子对接实验。
将黑沙蒿中已知的18种黄酮类化学成分与PPAR-γ进行分子对接，每个化合物给出9个分子对接结果，并按照亲和力进行排名。与阳性对照药罗格列酮相比，所有化合物与PPAR-γ的对接亲和力均低于罗格列酮，从中筛选得到5 个亲和力较高的化合物（绝对值大于8.0，罗格列酮为-8.7 kcal/mol），其中以化合物3为最高（-8.3 kcal/mol）。筛选结果见表4。
Table 4黑沙蒿中PPAR-γ激动剂虚拟筛选结果
化合物名称
分子式
最高
亲和力
亲和力
平均值
位于PPAR-γ LBD内构象数
与氨基酸残基的氢键结合
1
-8.2
-6.8
8
Tyr327
Arg288
2
-8.2
-6.7
4
Tyr327
3
-8.3
-6.7
6
Tyr327
Arg288
4
-8.2
-6.2
3
Tyr327
Arg288
5
-8.2
-6.7
7
Tyr327
Arg288
Ros
-8.7
-7.73
8
Tyr473
His323
Gln286
Ser289
阳性对照药罗格列酮与PPAR-γ LBD 的Tyr473、His323、Gln286、Ser289形成4个氢键结合(黄色虚线部分)，得分最高的化合物3（5,3′,4′-三羟基-7-甲氧基黄酮）与Tyr327、Arg288形成2个氢键结合(黄色虚线部分)。
Fig. 1罗格列酮和化合物3与 PPAR-γ LBD的对接构象. (A) 罗格列酮与PPAR-γ关键氨基酸残基Tyr473, His343, Gln286和 Ser289形成氢键结合 (-8.7 kcal/mol); (B) 化合物3与PPAR-γ关键氨基酸残基Tyr327和 Arg288形成氢键结合 (-8.3 kcal/mol).
筛选出的其它化合物均与PPAR-γLBD活性位点形成1个（Tyr327）或2个（Tyr327、Arg288）氢键结合。所有化合物与阳性对照药罗格列酮的结合模式均不同，提示对接亲和力及激动活性与罗格列酮有所不同。罗格列酮、化合物3与PPAR-γ受体的对接构象如图1所示。
4讨论
黑沙蒿提取物具有明显的抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及MRSA的活性。其中以乙酸乙酯提取物活性最强。为后续的黑沙蒿药效物质基础研究提供了活性导向。
炎症是机体组织对内外损伤因子所产生的一种局部的防御性反应，目前常见的抗炎药物筛选模型是小鼠耳肿胀法，炎症细胞浸润导致耳部急性渗出性的炎症水肿[17]。实验中黑沙蒿根提取物在小鼠抗炎实验模型中药效显著，接近或优于醋酸地塞米松组的药效，证明黑沙蒿根具有良好的抗炎效果。
分子对接中配体最佳对接模式的选择不仅需要考虑对接分数，同时应结合对接模型的构象观察[18-20]。阳性对照化合物与目标受体蛋白co-crystal的选择、受体蛋白的处理、对接流程及条件的优化以及阳性对照化合物的再对接试验至关重要。本文采用分子对接技术筛选得到的黑沙蒿PPAR-γ配体成分可能成为PPAR-γ激动剂的先导化合物。
5结论
黑沙蒿根具有明显的抗菌、抗炎作用，其中的黄酮类化合物可能通过与PPAR-γ靶点的结合产生抗糖尿病活性，本研究为黑沙蒿的药物用资源开发利用提供了研究基础及理论依据。
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作者简介
肖斌，药学博士，鄂尔多斯市中心医院主管药师，临床药学实验室负责人。多年来主要从事药物化学、药理学、分子对接等方面的研究。迄今发表论文10余篇，SCI论文9篇，以项目负责人承担各级科研立项8项。
