细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)凭借良好的结构稳定性、优异的生物兼容性及天然的转运能力，被用于多种癌症的治疗研究，并表现出优于传统纳米药物的疗效。其中，从动物乳汁(如牛奶)等食物提取的细胞外囊泡更具有成本低、易于规模化生产且有潜力作为口服制剂等优势，已有多项研究利用牛奶细胞外囊泡(milk-derived EVs, mEVs)作为药物载体实现肿瘤的靶向治疗。
然而，尽管mEVs能够解决细胞外囊泡产量低的问题，但相较于传统的脂质体纳米药物，载药效率低下仍是目前亟待解决的一个问题。此外，受限于不同来源、不同提取方法和不同批次EVs的差异，及其自身显著的异质性，如何对载药效果进行准确评估则是促进新型载药技术开发及质量控制的关键。
针对这两个问题，今天小编想介绍一篇近期发表在 Journal of Extracellular Vesicles 上的文章，题为'Active cargo loading into extracellular vesicles：Highlights the heterogeneous encapsulation behaviour'，集美大学的陈超翔博士与厦门大学的颜晓梅教授团队受传统脂质体药物启发，结合超声/挤出技术开发了一种名为'Sonication and Extrusion-assisted Active Loading (SEAL)'的新型载药技术，并以mEVs为模型，实现了阿霉素、米托蒽醌等可离子化小分子药物的高效装载，包封率较传统方法提高了数倍，与脂质体药物相当。
本文利用了纳米流式检测技术(nano-flow cytometry, NanoFCM)对载药mEVs进行单颗粒分析，快速实现载药效率的优化，显著提高了载药颗粒的比例和纯度。
首先，作者通过差速离心、超速离心、等电点沉淀和微滤膜分离等多种纯化方法从新鲜生牛乳中提取mEVs。将mEVs重悬于硫酸铵溶液后通过超声和挤出的方法促进硫酸铵进入囊泡内腔，并通过透析将主体溶液更换为PBS，建立质子梯度，进而实现阿霉素的主动装载(图1)。
图1. SEAL法制备Dox-mEVs原理示意图
鉴于荧光分光光度法只能得到总药物含量，无法揭示药物装载异质性，文章进一步通过NanoFCM对Dox-mEVs进行单颗粒分析(图2)。实验结果表明，通过被动孵育法制备的Dox-mEVs由于药物含量低无法检测到荧光信号，而SEAL显著提高了囊泡中阿霉素的含量，具有明显的荧光峰。然而，散射光与荧光的相关分析表明，只有不到20%的囊泡实现了SEAL主动装载。
图2. 通过NanoFCM对Dox-mEVs药物装载能力进行单颗粒表征
为了进一步揭示载药异质性与样品结构组成的关联，作者利用膜染料DiD对Dox-mEVs进行荧光染色，并利用NanoFCM进行多参数分析（图3）。结果发现，几乎所有主动装载了阿霉素的mEVs都能被DiD染色。文章进一步设计了一种基于脂质嵌入的膜亲和磁分离技术特异性地捕获具有膜结构的Dox-mEVs，成功地将载药囊泡的颗粒比例提升至63.2%。
图3. 膜染色相关分析及脂质亲和磁分离提高主动载药囊泡颗粒比例
为了考察纯化后的Dox-mEVs是否含有牛奶酪蛋白组装体，作者通过免疫荧光染色结合NanoFCM进行多参数分析(图4)。结果表明样品中仍含有一定数量的酪蛋白阳性颗粒，且这部分颗粒无法主动装载阿霉素分子。通过免疫磁分离技术选择性地去除这些酪蛋白自组装体，进一步将载药囊泡的颗粒比例提升至83.6%。
图4. 酪蛋白免疫荧光分析及免疫亲和磁分离提高主动载药囊泡颗粒比例
进一步通过体外细胞实验验证Dox-mEVs对肿瘤细胞的杀伤作用，并考察样品纯度(载药囊泡颗粒比例)的影响(图5)。结果表明，Dox-mEVs较传统阿霉素脂质体显示出更强的肿瘤杀伤能力，且在相同EV蛋白浓度下SEAL制备的Dox-mEVs细胞毒性更强，而去除杂质颗粒则能进一步提高该作用强度。接着，作者利用SEAL对mEVs进行吖啶橙(AO)荧光染料装载，通过NHS-amine反应在颗粒表面连接Alexa Fluor 647，并在囊泡表面连接肿瘤靶向配体转铁蛋白(Tf)，制备功能化AO-mEVs-AF647-Tf。荧光显微镜和流式细胞检测结果表明Tf修饰能显著提高AO-mEVs的细胞摄入程度，且经过一系列纯化的AO-mEVs-AF647-Tf较未纯化样品因装载AO的囊泡比例更高，具有更强的AO信号，而AF647信号没有显著改变。
图5. 细胞水平分析载药mEVs的肿瘤细胞摄入程度及杀伤作用
外源药物分子的高效装载是细胞外囊泡成功应用于药物递送及临床治疗的先决条件，尽管目前已开发出多种药物主动装载策略，但包封率仍远低于传统纳米药物。本文结合超声和挤出等EVs载药方式开发了一种名为“SEAL”的主动载药策略，显著提高了阿霉素等小分子药物的包封率。
此外，针对传统的包封率测定无法揭示EVs装载异质性，难以准确评估载药效率的问题，文中利用了NanoFCM这一单颗粒水平纳米分析利器对Dox-mEVs进行了粒径分布、颗粒浓度及装载效率的测定，并结合脂膜荧光标记和免疫荧光染色等方法进行多参数表征，快速优化分离纯化策略提高载药囊泡颗粒的比例。
NanoFCM具有超高的准确性和荧光分辨率，可以在单颗粒水平对EVs进行综合表征，得到全部EVs颗粒的粒径、浓度、蛋白表达比例和强度，是EVs载药研究的强有力工具，致力于加速EVs载药的研发进程！
参考文献
Chaoxiang Chen, et al.'Active cargo loading into extracellular vesicles: Highlights the heterogeneous encapsulation behaviour'Journal of extracellular vesicles 2021;10:e12163
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