题目：GhADF6-mediated actin reorganization is associated with defence against Verticillium dahliae infection in cotton
期刊名：Molecular Plant Pathology
作者：Yongduo Sun, Haiyun Wang
单位：中科院微生物所
小编寄语：一篇典型的通过基因沉默和转基因植株验证基因功能的文章。
背景
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已有的研究表明，肌动蛋白解聚因子 (ADF) 参与植物抗病反应。然而，功能机制似乎错综复杂，需要进一步探索。在这项研究中，研究者在陆地棉中发现了一个ADF6基因（称为GhADF6），该基因明显参与了棉花对真菌病原体黄萎病菌的反应。GhADF6 与肌动蛋白丝结合并在体外和体内具有肌动蛋白解聚活性。当棉花根部（真菌入侵部位）接种病原菌后，表皮细胞中GhADF6的表达明显下调。通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）实验，GhADF6的下调表达增强了棉花对V. dahliae的耐受性。
技术路线
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主要结果
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3.1 陆地棉对V. dahliae响应的ADF基因鉴定
为了确定哪些ADF对V. dahliae有反应，在V. dahliae接种后的不同时间点对根中具有高组成型表达的 20 个ADF的转录水平进行了量化（图 1a）。这些基因的表达模式是多样的。其中，GH_A09G0773/GH_D09G0714表现特别。其基因表达在接种后 6 小时后显著降低，并且在测试的时间范围内持续下调（图 1a）。转录表达的逐渐下降表明GH_A09G0773/GH_D09G0714可能持续负责棉花的防御反应。基于系统发育分析，GH_A09G0773/GH_D09G0714与拟南芥ADF6的关系最密切（图 1b）。因此，GH_A09G0773/GH_D09G0714 被命名为 GhADF6。
3.2 GhADF6 蛋白在植物细胞中与 F-actin 共定位
GhADF6 蛋白在体内的亚细胞分布结果显示。增强型绿色荧光蛋白 (eGFP) 标记的 GhADF6 (GhADF6-eGFP) 通过农杆菌侵染本氏烟草的表皮细胞中与特征良好的肌动蛋白报告基因 fABD2-mCherry 共表达。以游离 eGFP 和 fABD2-mCherry 的共表达作为对照，使用共聚焦显微镜观察融合蛋白的瞬时表达。如图所示，GhADF6-eGFP 融合蛋白（非游离 eGFP），表现出与fABD2-mCherry的荧光模式相匹配的分布模式，证明GhADF6 定位于 F-肌动蛋白。同时，还在细胞核中观察到 GhADF6-eGFP。
3.3 GhADF6沉默的棉花植株对V. dahliae的耐受性更强
为了研究GhADF6下调对V. dahliae感染的生理意义，首先通过TRV诱导的基因沉默 (VIGS) 技术创建了GhADF6表达量降低的陆地棉植物。在农杆菌介导的 VIGS 浸润两周后，白化病表型出现在棉叶上，从而证实了我们的实验条件下的 VIGS 效率。沉默GhADF6 ，对应于GhADF6 mRNA 3'非翻译区 (UTR) 的 243-bp 片段的序列被克隆到 VIGS 载体中，然后将含有该构建体的农杆菌细胞浸润到棉花子叶中。两周后，从顶部叶子中提取总RNA，以通过RT-qPCR验证沉默能力。如图5b所示，与对照相比，GhADF6 沉默的幼苗中的GhADF6 mRNA 水平下降了约 80% 。
随后，将GhADF6沉默的和对照的棉花植株接种V. dahliae，并分析和比较疾病相关症状。尽管对照植物的叶子在接种后 20 天（dpi）出现黄色并严重枯萎，但GhADF6沉默植物的症状似乎明显较弱（图 5a）。GhADF6沉默的植物的疾病指数（DI）显着低于对照（图 5c）。这些结果表明，GhADF6的下调可以对棉花植物的抗病性产生积极影响。
3.4 GhADF6的下调增加了棉花根表皮细胞肌动蛋白丝的比例
研究者观察到棉花根部中的肌动蛋白丝和肌动蛋白束对黄萎病菌的反应都有所增加。为了观察GhADF6沉默的棉花植物与野生型植物相比的肌动蛋白结构变化，检测了根表皮细胞中的肌动蛋白丝。对在水培条件下生长的棉花植物的根进行显微镜观察。与对照相比，GhADF6沉默的植物根中肌动蛋白丝的丰度和肌动蛋白束的程度均显着增加（图6a）。在GhADF6沉默的植物中，肌动蛋白丝的百分比高于对照植物（图 6b，c）。
结论
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研究者的结果表明：植物需要增加丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）丰度和通过动态肌动蛋白重塑从而防御病原体入侵。
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