【Plant Biotechnol J】花生单细胞测序鉴定叶片发育的关键转录因子

文章信息

题目：Single-cell RNA-seq describes the transcriptome landscape and identifies critical transcription factors in the leaf blade of the allotetraploid peanut (Arachis hypogaea L.)

刊名：Plant Biotechnology Journal

日期: 26 June 2021

作者：Hao Liu, Yanbin Hong et al.

单位：广东省农业科学院作物研究所‍

摘要

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单细胞 RNA-seq (scRNA-seq) 已成为描述人类细胞转录组的常用工具，但该技术尚未广泛应用于植物细胞。这里，研究者描述了一个在花生叶中成功开发的原生质体细胞分离系统。基于标记基因，应用 scRNA-seq 将总共 6,815 个单细胞分成 8 个细胞簇。使用伪时间分析来描述叶片生长过程中不同细胞类型的转录因子（TF）的发育轨迹和相互作用网络。该轨迹使重新研究叶肉和表皮的原基驱动的发育过程成为可能。这些结果表明栅栏细胞可能分化为海绵状细胞，而表皮细胞起源于叶原基之前。根据获得的 scRNA-seq 结果，几种 TF 的表达水平与表皮个体发育密切相关。此外，花生AHL23 ( AT-HOOK MOTIF NUCLEAR Localized PROTEIN 23 ) 位于细胞核中，通过调节植物激素途径在拟南芥中异位表达时促进叶片生长。

技术路线

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主要结果

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3.1 花生叶原生质体细胞的分离及scRNA-seq

花生幼苗在黑暗环境中生长一周，然后从叶柄上摘下黄化叶片并切成小条。然后将叶条转移到 30 ml 纤维素酶和果胶酶溶液中并轻轻摇动 2 小时以分离原生质体。通过用台盼蓝染色来评估细胞活力。每微升获得了超过 1280 个原生质体细胞。显微镜观察确定活细胞的百分比超过94%。（图 1a）。然后使用 10x Genomics scRNA-seq 平台进行测序分析。

3.2 花生叶主要细胞簇的鉴定

因此，获得了 6,815 个单细胞的转录组谱，并通过分析总 UMI（唯一分子标签）计数来表征。数据过滤后，鉴定了 4604个基因。随后，将它们锚定到 20 条花生染色体中，以分析花生叶细胞的单细胞基因表达模式。为了在对不同细胞类型的群体进行可视化，数据通过主成分分析使用降维进行分层，从而产生 6,815 个由t-SNE聚类的单细胞从而验证参与叶片发育的不同细胞类型。（图 1b) 。

基于在栅栏叶肉、海绵状叶肉、表皮、原基、韧皮部、束鞘、实质和气孔保卫细胞中的不同作用，根据簇特征表达的 DEG，将所有单细胞分配到八个主要细胞簇 中（图1c）。每个亚组包含28 到 3216 的单个细胞。只有栅栏叶肉和海绵状叶肉细胞簇分别被分为两个和三个子簇（图 1d-e）。不同细胞簇的鉴定不仅有助于收集有关细胞类型的基本信息，而且有助于进一步表征标记基因和分析细胞异质性。

Fig. 1

3.3 花生叶肉细胞发育过程

叶肉层是光合作用的主要场所。它的细胞数量最多，由两种不同的细胞类型组成，构成栅栏组织和海绵组织。目前，人们认为叶肉层起源于原基的一部分，然后在最终形成叶肉层之前发展成薄壁组织。为了验证这一假设，分析了原基、实质和叶肉细胞簇，以描述叶肉层的发育轨迹。

通过研究沿时间线的细胞分化方向，原基首先发育为实质细胞，然后进一步发育为栅栏层。然而，研究者发现几乎没有证据支持原基直接转化为海绵组织（图 4a）。沿着伪时间轨迹的主干共鉴定出 3942 个 DEG，差异表达谱中存在 193 个 TF（图 4c），其中 73 个 TF 被鉴定为在生物钟/或植物激素途径中（图 4d）。

大多数 TF 在状态 1 中高度表达，很明显 JA 和 ETH TF 分别调节状态 4 和状态 5（图 4e）。发育轨迹的主干出现两个分支点，栅栏细胞层亚群分裂成海绵状组织，集中在分支点一，而原基分支成实质细胞和海绵状细胞，集中在分支点二（图 4a-b）。与 JA/ETH、ABA 和氮代谢途径相关的 25 个关键 TF 的相互作用网络被证明可以影响叶肉层的发育（图 4g）。总体而言，根据轨迹分析描述了从原基和实质到叶肉细胞类型的分化模式。实质细胞保持了向海绵状细胞和栅状细胞转化的能力，并且提出了栅状细胞能够在花生叶中发育成海绵状组织的概念（图 4h）。这些结果可能有助于未来了解叶片中叶肉层的发育机制。

Fig. 4

3.4 花生AHL23促进异位表达的拟南芥叶片生长

在上述结果中，有多种对叶肉和表皮发育很重要的转录因子。为了确定它们在叶片生长中的分子功能，我们发现AHL23 转录本丰度在不同的花生品种中差异表达。

花生AHL23编码序列为 882 bp。蛋白质结构包含典型的 AT-hook 和 DUF296 结构域（图 7a）。系统发育分析表明，AHL23与MtAHL23和SlAHL23相似（图 7b）。瞬时表达结果显示，AHL23蛋白主要定位于拟南芥原生质体细胞核（图 7c）。AHL23转录物在花生荚和根组织中高度富集，但在叶或茎等其他区域的表达较低，这表明AHL23的表达可能在黑暗条件下被激活。

此外，AHL23在拟南芥中异位表达以产生AHL23-OX（过表达）转基因系，在幼苗阶段，AHL23激活下胚轴伸长（图 7d-e），在正常生长条件下，与野生型（WT）相比，子叶略大（图 7f-g）。在营养生长阶段，与 WT 相比，无论是在叶片扩张还是整体植物大小方面，AHL23-OX系的生长速度显着提高（图 7h-i）。

叶片的显微观察显示，与 WT 相比，AHL23过表达增加了表皮细胞数量，但并未导致细胞大小增加。这表明AHL23能够正向调节表皮增殖。有趣的是，AHL23过表达促进了叶片的扩张（图 7j），并且提升株高（图 7m）并在生殖生长期诱导提前开花（图 7k）。花生AHL23过表达在拟南芥中表现出更好的营养和生殖生长，并且开花时间比WT植物早至少10天（图 7l）。AHL23调节叶片生长的机制仍不清楚。因此，研究者收集了转基因植物的叶组织，以便通过 LC-MS 检测 88 种植物激素。AHL23过表达植株乙烯前体ACC（图 7n）、JA和OPDA（图 7o）、细胞分裂素衍生物IPR和iP9G（图 7p）、生长素合成前体TRP、生长素衍生物IAA-Leu和IAA-Val（图 7q）的含量和独脚金内酯前体 5DS（图 7r）都显著增加，但 GA19 的水平（图 7s) 和水杨酸 (图 7t )下调。AHL23不影响脱落酸 (ABA) 途径。

Fig. 7

总结

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除了揭示基因表达图谱外，scRNA-seq 还将用于植物研究的多个领域，尤其是研究对生物和非生物胁迫的反应。在植物组织中广泛检测到环境胁迫引发的转录组谱变化，但尚未在单细胞水平上探索诱导转录组变异的特定因素，如干旱、紫外线辐射或化学诱变。通过将单细胞分离与全长转录组分析相结合，可以检测到单个体细胞中转录物表达水平和结构的变化，从而更好地了解植物对环境胁迫的适应性

总之，我们的研究表明，scRNA-seq 的应用可以提供关于花生叶片细胞分化的新假说。这种方法将使异源四倍体花生和其他植物物种中叶片细胞的功能研究取得重大进展。

获取原文

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原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.13656

补充材料：

https://onlinelibrary.wiley.com/action/downloadSupplement?doi=10.1111%2Fpbi.13656&file=pbi13656-sup-0001-FigS1-S14.pdf

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