文章信息
题目：Interaction of two MADS-box genes leads to growth phenotype divergence of all-flesh type of tomatoes
刊名：nature communicationsPublished date: 25 November 2021
作者：Baowen Huang, Mondher Bouzayen et al.
单位：Chongqing University
摘要
1
全肉番茄品种没有腔室凝胶，并表现出更强的硬度和改善的采后储存特性。在这里，作者证明SlMBP3是番茄果实中腔室组织的主要调节因子，并且该基因位点的缺失导致了全肉性状。我们通过在SlAGL11基因座（ SlMBP3的密切同源物）处发现自然突变来解决这种表型差异的因果因素。错误表达SlMBP3在果实发育的初始阶段通过大量转录组重编程损害腔室凝胶形成。SlMBP3通过控制细胞周期和细胞扩增基因来影响细胞室凝胶的形成，表明果实软化的重要成分是在早熟早期阶段决定的。研究结果确定了改善番茄和其他肉质水果质地的潜力。
技术路线
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主要结果
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3.1 番茄果实内部组织结构的多样性与SlMBP3基因座内的等位基因变异有关
据报道，番茄 D 类SlMBP3的下调导致含有凝胶的栽培品种 Ailsa Craig (AC) 转化为非凝胶全肉型。然而，这种突变与会引起植物生长缓慢、果实大小急剧减小和种子发育受损，完全无法发芽。引人注目的是，这些表型在全肉商业品种中不存在，这些品种产生大果实，种子表现出最佳发芽能力（图 1a）。SlMBP3基因座的测序揭示了所有六个全肉种质中位于 5'-UTR 上游 77 bp 的区域中存在 405 bp 的缺失（图 1b）。正如通过 PCR 扩增所证实的那样，在富含凝胶的品种中没有发现这种缺失。无论腔室凝胶的类型如何，在 12 个番茄品种的SlMBP3编码序列中均未发现序列变异。在全肉品种的SlMBP3启动子中删除的 405 bp 序列中的推定Cis调节元件的计算机搜索确定了几种类型的保守顺式元件，包括 bZIP、C2H2、CPP、GRAS、HD-ZIP、NAC、Nin，WRKY。这些数据表明该基因非常保守，启动子内的缺失片段代表了SlMBP3的唯一变异基因座，因此，该基因座可能是导致番茄全肉性状的原因。
3.2 SlMBP3是决定番茄果实腔室凝胶组织分化的因果因子
在番茄中，SlMBP3及其最接近的同源物SlAGL11属于 D 类 MADS-box 家族，并且与拟南芥中独特的 D 类基因AtSTK高度相似（编码序列内的相似性高达 75%）。与拟南芥AtSTK突变导致胚珠、种子和菌珠异常相比，番茄中SlAGL11的下调不能产生任何果实表型，而其过表达可以介导萼片的同源异形转化为肉质器官。
3.2.1 过表达结果
通过评估它在十二个番茄种质中转录水平的表达，这些番茄种质在腔室中显示出差异很大的组织类型。值得注意的是，不同番茄种质中腔室凝胶的存在与否与SlMBP3转录水平密切相关，在缺乏凝胶组织的全肉品种中发现的水平最低，而在富含凝胶的品种中最高（图 1c）。由于所分析的所有六种全肉种质都具有完全相同的缺失，该序列变体可能是这些栽培品种中SlMBP3表达不足的原因（图 1b、c）。
进一步评估全肉性状与SlMBP3基因表达水平之间的联系，使用由其天然启动子 ( proSlMBP3::SlMBP3 ) 或 CaMV-35S 启动子 ( 35S::SlMBP3 ) 驱动的SlMBP3 CDS在三种不同的全肉品种（Gades、Redsky 和 TP366）中产生过表达系。两种构建体的过表达导致在三个种质中从全肉到果冻型腔室组织的转化，而proSlMBP3::SlMBP3导致较弱的SlMBP3表达水平和腔室凝胶部分恢复（图 1d ）。值得注意的是，在过表达SlMBP3的全果肉系中，从非凝胶型到凝胶型腔室组织的转变与早在开花后 10 天（DPA）开始的果实柔软度显著有关（图 1d）。这有力地支持了全肉体性状与SlMBP3表达减少相关的假设。
3.2.2 CRISPR/Cas9和RNAi结果
然后，通过 CRISPR/Cas9 或 RNAi 方法实施基因编辑，更广泛地验证了SlMBP3在腔室凝胶形成中的功能。获得了12 个独立的 SlMBP3 -KO 突变系。所有这些功能丧失的突变体在果实室组织纹理上显示出显着的表型（图 1a），完全没有凝胶组织（图 2a）。SlMBP3 -RNAi 系中果实表型的严重程度与下调程度密切相关，进一步证明了SlMBP3表达水平与腔室凝胶形成之间的相关性。与单SlMBP3 -KO相比，双SlMBP3/SlAGL11- KO 系导致较小的植物，果实大小和重量显着减小，种子发育不全，甚至完全无法发芽。
3.3 SlMBP3的表达是导致腔室凝胶组织形成的原因而非SlAGL11的表达
番茄果实切片的甲苯胺蓝染色提供了一种可视化区分全肉和富含凝胶的组织类型20的眼部组织结构/纹理差异的方法。在 WT 果实中，腔室充满果冻状组织，显示出弱染色或没有甲苯胺蓝染色，而SlMBP3 -KO 和 RNAi 果实中，重度染色的眼部组织缺乏独特的果冻特征，并且显示细胞厚而良好- 定义的壁类似于胎盘和中央小柱组织（图 2b）。值得注意的是，双SlMBP3/SlAGL11 -KO 果实的眼部组织在所有方面都与单SlMBP3- 相似KO 果实，较厚的细胞壁被甲苯胺蓝强烈染色（图 2b）。过表达SlMBP3的果实表现出丰富的果冻状组织，没有甲苯胺蓝染色（图 2a，b）。这些数据表明，SlMBP3有助于将眼组织从实质型转变为凝胶型的发育程序。重要的是，SlMBP3 -KO 或双SlMBP3/SlAGL11 -KO 系中眼组织结构的改变与果实硬度的显着增加有关（图 2c）。这些数据表明，只有 SlMBP3 的表达，而不是SlAGL11的表达，是腔室凝胶分化所必需的，并进一步证实了果实硬度与前面描述的全果肉性状之间的联系（图 1d）。
值得注意的是，SlMBP3 -KO 番茄果实的保质期有所延长，如在室温下储存数周时具有更高的抗腐烂性（图 3a）。除了延长保质期外，果实还显示出显着更高的干物质和糖含量（图 3b、c）。这些特征表明，当水果用于加工时，全肉特性赋予了水果额外的品质。
3.4 SlMBP3是眼部组织发育的主要调节剂
为了更好地解读SlMBP3在控制番茄果实内部组织分化中的作用，我们产生了一系列独立的转基因系，表达由SlMBP3或SlAGL11启动子驱动的 GUS 报告基因。研究表明，SlMBP3表达在花授粉和坐果之前开始，然后在室组织中最高，因为它分化成凝胶，并且在整个果实发育过程中也在种子和绳状体中（图 4a）。相比之下，在花受精前检测不到SlAGL11的表达。SlAGL11的种子优先表达通过在没有花授粉/受精的情况下发育的生长素诱导的单性结实果实中不表达而进一步维持（图 4b）。相比之下，SlMBP3在生长素诱导的单性结实果实的胎盘中表现出一致的表达（图 4b）。这些独特的表达模式分别表明SlAGL11和SlMBP3在种子发育和胎盘组织分化中的特定作用。
3.5 CHIP-seq和RNA-seq结果
通过全基因组 ChIP-seq 方法推定的 SlMBP3的靶基因。免疫沉淀 DNA 的测序揭示了 2363 个峰，其中 48.2% 位于注释基因上游的 3-kb 区域内（图 5c）。MEME-ChIP 软件显示，最常见的 SlMBP3 结合序列对应于 10-bp CC(A/T) 6CArG-box 的 GG 基序与其他番茄 MADS 转录因子如 RIN、FUL1 和 FUL2 21的已知结合位点相匹配（图 5d）。交叉引用 ChIP-seq 和 RNA-seq 数据确定了 450 个基因既是SlMBP3靶标，又在SlMBP3 -KO 眼组织中显示差异表达（图 5e）。因此，我们假设 RNA-seq 和 ChIP-seq 数据共有的细胞壁相关基因是最佳候选基因，这可以解释 SlMBP3 -KO 果实表现出的显着硬度和SlMBP3 -OX果实的柔软性。
结论
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总体而言，该研究的结果朝着解决腔室组织分化的分子基础迈出的一步，并为设计番茄品种和具有特定质地特性的其他肉质水果的育种策略提供了新的机会。这些品种将更适合番茄加工，新鲜水果的延长保质期并且有助于减少浪费。
原文链接
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https://www.nature.com/articles/s41467-021-27117-7#Sec9
补充材料：
https://static-content.springer.com/esm/art%3A10.1038%2Fs41467-021-27117-7/MediaObjects/41467_2021_27117_MOESM1_ESM.pdf
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