【HORTIC. PLANT J.】通过CRISPR/Cas9对甘蓝进行靶向点突变

文章信息

题目：Efficient Generation of Targeted Point Mutations in the Brassica oleracea var. botrytis Genome via a Modified CRISPR/Cas9 System

刊名：Horticultural Plant Journal

作者：Guixiang Wang et al.

单位：Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences

Available online: 21 January 2022‍

摘要

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在这项研究中，使用改良的 CRISPR/Cas9 系统在花椰菜中产生靶向点突变。选择乙酰乳酸合酶（ALS）和着丝粒特异性组蛋白H3变异体（CENH3）基因作为基因编辑靶点，并以花椰菜的下胚轴作为外植体。对于ALS基因，Pro182 的密码子 (CCT) 中的 C 到 T 转换可以改变编码的氨基酸，可能导致除草剂抗性，以及CENH3基因中 Leu133 的密码子 (CTT) 中的 C 到 T 突变可能产生单倍体诱导物。结果表明转化效率为 1.8%–4.5%，ALS和CENH3基因的突变效率为分别约为 22% 和 87%。ALS 突变花椰菜表现出很强的除草剂抗性，可能对花椰菜田中的阔叶杂草控制产生直接影响。

背景

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花椰菜（Brassica oleracea var. botrytis）是主要栽培蔬菜品种，具有自交不亲和性和春化开花特性。这些特征显着增加了利用物理或化学诱变剂产生的新种质的难度。

精确的基因组编辑技术，尤其是 CRISPR/Cas9，为研究人员提供了创建靶向点突变和改进植物种质的可行选择。Komor 等发现一种包含 Cas9 和胞苷脱氨酶的融合蛋白能够在由大约 5 个核苷酸组成的片段内将 C 转化为 T（或 G 转化为 A），其非常适用于在特定基因座引入点突变而无需加入供体 DNA 模板。改进后的系统名为 BE3（APOBEC1-XTEN-nCas9-UGI，第三代碱基编辑器）被用于水稻、拟南芥和西瓜的碱基编辑。然而，这个新系统是否能有效地在重要的芸苔属作物中引入点突变还需要进一步验证。

技术路线

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主要结果

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4.1 突变位点

使用 BE3 系统在花椰菜中有效诱导可遗传诱变。选择编码乙酰乳酸合酶（ALS）和着丝粒特异性组蛋白H3变体（CENH3）的基因作为碱基编辑目标，评估了碱基编辑载体在花椰菜中的效用。ALS基因中几个保守位置的单点突变可导致不同植物物种对除草剂的抗性。Pro182 密码子（CCT）中的 C 到 T 转换可以改变编码的氨基酸，可能导致花椰菜对除草剂的抗性（图 1a）。据报道， CENH3基因的 Leu133 密码子 (CTT) 的 C 到 T 突变可导致氨基酸变化，从而损害着丝粒，从而导致大麦、甜菜和拟南芥中的产生单倍体植物。因此本研究选择CENH3基因的Leu133密码子（CTT）作为靶向碱基突变的修饰位点（图1a）。

将选定的靶序列克隆到 pHSE901 中，在双 35S 启动子的控制下表达 BE3，从而改变拟南芥基因组靶序列中 4-9 个位置的 C 碱基（图 1 )。重组质粒用于通过根癌农杆菌介导的转化花椰菜系'Korso_1401'的下胚轴。

4.2 编辑效率统计

对于ALS和CENH3基因，经过三轮Basta选择（草铵膦3mg·L-1）和再生后，我们分别转化了1000个下胚轴并获得了18和45个独立株系。PCR扩增结果证实所有受试候选植物均含有nCas9和gRNA片段，表明转化效率为1.8%-4.5%。引物 ALS-7 和 ALS-762 用于扩增跨越ALS基因 Pro182 区域的片段。引物 CENH3-245 和 CENH3-457 用于扩增包括 CENH3 的 Leu133 区域的片段基因。Sanger 测序结果显示，18 株植物中有4株在靶向ALS基因中有 C-to-T 突变，45 株中有 39 株在靶向CENH3基因中有 C-to-T 突变。因此，ALS和CENH3基因的突变效率分别约为 22% 和 87%。因为ALS基因的 Pro182 密码子 (CCT) 中的任何一个 C 碱基都可以独立或同时转化为 T 碱基，所以四种植物在第 7 位和第 8 位（C7C8 到 T7T8）都有 C-to-T 取代（图 1c，d)。

为了测试碱基编辑的点突变是否可以有效地传递给下一代，随机选择 ALS 系#1（T 0植物具有杂合 C7C8T9 到 T7T8T9 变化）和 CENH3 系#2（杂合 C5T6T7 到 T5T6T7 变化）用于分析（图 1 d）。基因分型结果表明，在 T 1在 ALS 系 #1 的生成中，纯合、杂合和野生型 (WT) 植物的频率分别为 42% (21/50)、52% (26/50) 和 6% (3/50)，其中与基于孟德尔分离定律的预测频率不一致。CENH3 系#2 获得了类似的结果，分别有 60% (12/20) 和 40% (8/20) 的植物被鉴定为纯合和杂合突变体。这些结果表明，在 T 1的繁殖阶段，可以重新编辑突变以重新引入 WT 等位基因。

尽管这种重新编辑使编辑的等位基因的分离相当复杂，但结果清楚地表明，碱基编辑的点突变有效地传递给了下一代。我们系统的碱基编辑效率超过22%，在T0代高达87% 。相比之下，在以往的研究中，西瓜的碱基编辑效率为 23%，而水稻的碱基编辑效率为 17%–38%。

4.3 除草剂抗性鉴定

为了测试ALS点突变是否是花椰菜抗除草剂的原因，纯合P182F植物和WT用苯磺隆处理，这对控制阔叶杂草非常有效。在处理后20 d 时，所有野生型植物在200 g·hm -2（推荐的田间施用量）和400 g·hm -2的苯磺隆（活性成分含量10%）下均受到损害。导致生长缓慢，叶子枯黄。

相反，纯合P182F植物不受除草剂施用的显着影响（图1e）。此外，WT植物在800 g·hm -2时受到苯磺隆的严重破坏，最终停止生长并死亡。尽管它们受到800 g·hm -2处理的轻微伤害，但纯合P182F植物能够在处理后20天内恢复正常生长。这些结果表明，近 35 种市售磺酰脲类除草剂可能适用于本研究中开发的抗除草剂花椰菜种质。

总结

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总之，该研究向花椰菜基因组中的目标基因座引入了精确的点突变。该策略可应用于芸苔属植物基因组的靶向编辑。与 HDR 介导的基因替换方法相比，碱基编辑方法能够更有效、更容易地进行靶向碱基校正。此外，本研究产生的抗除草剂花椰菜植物可直接应用于花椰菜田阔叶杂草的防治，也为靶向点突变改良农业重要芸薹属植物提供思路。

获取原文

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原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468014122000139

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