文章信息
题目：SlMIR164A regulates fruit ripening and quality by controlling SlNAM2 and SlNAM3 in tomato
刊名：Plant Biotechnology Journal
作者：Tengbo Huang， Dongbo Lin
单位：Shenzhen University
日期：11 April 2022
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摘要
miRNA是植物发育的重要转录后调节因子。但单个MIRNA基因的具体作用在很大程度上是不确定的。在这里，我们描述了番茄中 Sly-miR164 的主要基因之一SlMIR164A的功能和调控机制。我们表明，SlMIR164A在果实发育的后期优先表达，在控制果实成熟和品质方面起着至关重要的作用。通过 CRISPR/Cas9 介导的诱变SlMIR164A功能丧失，导致果实加速成熟和叶绿体发育增强，从而导致糖和有机酸含量发生改变，影响果实的营养品质。我们还表明，SlMIR164A通过特定靶基因SlNAM2和SlNAM3调节果实成熟和品质，这些基因控制叶绿体功能和果实成熟过程的关键调节因子。MIR164基因已被证明可在多种植物中，在调节器官衰老（如叶片衰老和果实成熟）中发挥作用，但它们在番茄中的家族成员是否以及如何发挥相同功能仍有待阐明。我们的结果揭示了SlMIR164A以前未被发现在果实成熟控制方面的作用，这将进一步了解MIR164家族的作用，以及番茄果实成熟和质量控制的机制。此外，由于SlMIR164A的损失对器官形态的影响较小，我们的结果可用于番茄育种，以促进番茄在农业中的改良。
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技术路线
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主要结果
3.1 MicroTom 中 Sly-miR164 和SlMIR164A/SlMIR164B基因的表达分析
为了评估 MicroTom 中 Sly-miR164 的表达模式，我们首先对不同发育阶段的不同番茄组织进行了Northern blot实验。虽然在所有样品中都检测到了 Sly-miR164 的表达，但我们发现它在茎尖分生组织、幼叶原基和后期花中积累的程度更高（图 1a-b）。由于番茄是研究果实发育的模式植物，我们专门分析了 Sly-miR164 在不同果实阶段的表达。我们检测到 Sly-miR164 在果实发育过程中的成熟阶段（开花后 30 到 45 天）优先表达（图 1c）。
在此分析之后，我们还对主要的SlMIR164A和SlMIR164B进行了 qRT-PCR 测定，以检查它们各自对 Sly-miR164 整体表达的贡献。我们发现SlMIR164B在营养和花期比SlMIR164A转录更活跃，而SlMIR164A的表达主要在发育果实中检测到（图 1d-f） 。将该结果与northern印迹的结果进行比较时，可以看出由SlMIR164B产生的Sly-miR164分子可能是营养器官和花器官中整个 Sly-miR164 的主要贡献者。此外，我们还生成了含有SlMIR164Apro:GUS报告基因的番茄转基因系，并在后期果实中 检测到了强的SlMIR164Apro:GUS活性（图S1 a-b），这进一步证实了qRT-PCR 显示的SlMIR164A的表达特异性。总之，这些数据表明SlMIR164A和SlMIR164B具有不同的时空表达模式，这表明这两个SlMIR164基因可能对 Sly-miR164 在番茄发育中的整体活性有明显贡献。特别是，SlMIR164A和 Sly-miR164 在果实后期的特异性表达强烈提示从 SlMIR164A 产生的 Sly-miR164可能在 MicroTom 果实发育后期（如果实成熟）的过程中发挥重要作用。
3.2 SlMIR164A的CRISPR/Cas9突变体的产生和表型分析
为了进一步表征SlMIR164A的功能，我们利用 CRISPR/Cas9 系统在 MicroTom 背景中创建了 SlMIR164A突变体 ( slmir164a CR )。我们设计了一对识别 SlMIR164A 前体序列的向导 RNA (gRNA)，并将它们转化到野生型 MicroTom 植物中（图 S2 a）。我们获得了多个独立的T1转基因品系，其中Sly-miR164序列在SlMIR164A基因中完全缺失，并选择了三个纯合植物进行详细分析（图 S2b 和 c)。我们通过northern印迹评估了每个转基因系果实中Sly-miR164的水平，并检测到与野生型相比， 所有三个slmir164a CR突变体中Sly- miR164的丰度均显着降低（图S2d ）。我们还发现Slmir164a CR和野生型中 SlMIR164B 的表达相似（图 S2 e ），表明 SlMIR164B 的转录不受 SlMIR164A缺失的影响。然后我们对这些slmir164a CR系进行了详细的表型分析。
首先观察到slmir164a CR与野生型相比，植物的营养器官和花生长几乎没有明显变化，除了叶片锯齿数量增加（图 S2 f-l），这与SlMIR164A在营养和花发育中 的弱表达一致（图1d -e )。此外，slmir164a CR植物的果实也具有与野生型相似的周长、面积和重量（图 S2 m-q）。这些结果表明，SlMIR164A可能在 MicroTom 的器官形态的调节中起关键作用，并且不同的SlMIR164A基因可能在不同的番茄品种中发挥特定的作用。虽然slmir164a CR中SlMIR164A的缺失不会导致果实形态发生强烈变化，但我们注意到其在果实成熟过程中的显着影响，这与SlMIR164A在果实成熟阶段的强表达一致（图 1f ;图 S1 )。
slmir164a CR最重要的表型是果实较早成熟。相对于野生型 ， slmir164a CR从开花到开始成熟的时间减少了约 5 天（图2a-b）。我们还检查了成熟果实中乙烯的产生和主要色素（番茄红素、叶黄素和β-胡萝卜素）的积累。我们发现这些关键的成熟相关参数在slmir164a CR中均高于野生型（图 2c-f），这进一步支持了Slmir164A功能丧失加速果实成熟。此外，我们发现外源乙烯处理诱导了SlMIR164A的表达，导致果实中 Sly-miR164 的水平增加（图 2g-i），而乙烯抑制剂 1-甲基环丙烷（1-MCP）的应用抑制了转录SlMIR164A的和 Sly-miR164 的积累（图 2j-l）。这表明在 MicroTom 发育成熟阶段显着升高的SlMIR164A和 Sly-miR164 表达可能归因于乙烯的诱导。随着slmir164a CR中乙烯水平的增加，这表明SlMIR164A对乙烯生物合成具有抑制作用，我们建议SlMIR164A可能介导乙烯生产的负反馈调节，以微调 MicroTom 中的果实成熟过程。
由于果实成熟和叶绿体发育的改变都会影响果实代谢，特别是糖和有机酸化合物的代谢，影响果实的营养品质，因此我们还分析了果实中淀粉、葡萄糖、果糖和主要有机酸的含量。slmir164a CR和野生型的成熟果实。我们发现， slmir164a CR中淀粉和所有有机酸的水平在大多数被检查的果实阶段都升高（图 4a，d -i），而葡萄糖和果糖的丰度从 30 dpa 增加到 35dpa，并在后期下降与野生型相比 ， slmir164a CR在果实成熟过程中（图4b-c）。这些数据表明，SlMIR164A还起到调节果实代谢的作用，并最终影响 MicroTom 中的果实品质。
除了早熟表型外，我们还注意到slmir164a CR果实在未成熟和成熟绿色阶段形成许多深绿色斑点（图 3a），类似于叶绿体功能增强的番茄突变体（Wu et al ., 2020）。然后，我们评估了slmir164a CR与野生型相比的果实叶绿素含量和叶绿体发育。我们的研究结果表明， slmir164a CR果实的叶绿素水平、叶绿体数量和光合效率均高于野生型（图 3b-d，f，g）。此外，我们使用透射电子显微镜 (TEM)分析了slmir164a CR果实和野生型可比果实区域的深绿色区域果皮中的叶绿体结构。我们发现，与野生型相比 ， slmir164a CR的叶绿体面积、类囊体颗粒的数量以及叶绿体中质体球的数量和大小均有所增加（图3e，h -k）。由于这些深绿色斑点在橙色和红色果实阶段变黄，我们还使用 TEM 来检查成熟果实黄色区域果皮中色素体的结构。一致地，我们在slmir164a CR中检测到更大的色质体区域和每个色质体更多的质体球与野生型相比（图 3l-n）。总之，这些结果表明，SlMIR164A在调节 MicroTom 中叶绿体和色质体的发育方面起着至关重要的作用。
3.3 Sly-miR164靶向NAC基因在番茄中的表达和系统发育分析
NAC家族成员SlGOB、SlNAM1、SlNAM2和SlNAM3是Sly-miR164的主要靶基因。为了阐明这四个基因如何通过SlMIR164A调控果实成熟和品质，我们在 RNA-seq 数据中专门检查了它们在slmir164a CR中相对于野生型的表达。我们发现SlNAM2和SlNAM3的表达比SlGOB和SlNAM1在slmir164a CR与野生型相比（图 S4b）。我们使用 qRT-PCR 进一步证实了 RNA-seq 结果，其显示在 30、35和 42 dpa 时， slmir164a CR果实中SlNAM2 / SlNAM3转录的特异性诱导（图S4 c-e）。我们还评估了这些NAC基因在野生型果实发育阶段的表达（图 S4 f），并将它们的模式与SlMIR164A的模式进行了比较（图 1f）。我们观察到SlNAM2和SlNAM3在果实早期高表达，显示出与SlMIR164A表达互补的模式，而SlGOB和SlNAM1在果实发育过程中均具有较低的转录水平（图 S4 f；图 1f）。这些结果表明，SlNAM2和SlNAM3可能作为主要靶标来调节SlMIR164A在果实成熟和质量控制中的功能。我们对拟南芥、番茄和猕猴桃中靶向 miR164 的NAC基因的系统发育分析也支持了这一假设。这表明SlNAM2 / SlNAM3与衰老和成熟相关的NAC更密切相关，例如ORE1、AdNAC6和AdNAC7 (图 S4 a)。
3.4 SlNAM2和SlNAM3促进簇1中叶绿体/光合作用相关基因和簇2中果实成熟相关基因的转录
为了进一步研究SlNAM2和SlNAM3如何通过其靶标介导SlMIR164A对果实成熟和品质的调控，我们评估了 RNA-seq 结果揭示的SlMIR164A下游通路中 NAC 转录因子的推定靶基因分布。我们首先分析了六个簇中 DEGs 启动子上存在的 NAC 结合位点 (NACBS) ，发现 NACBS 在簇 1 和簇 2 中富集（图 S5 a)。这表明这两个簇中的大量基因可能直接受SlNAM2和SlNAM3。有趣的是，GO 分析表明簇 1 中的光合作用和叶绿体发育调节剂的富集，以及簇 2 中果实成熟过程的调节剂的富集（图 S5 b，c；数据S4），这与SlMIR164A所示的两个关键功能一致slmir164a CR的表型分析。具体而言，簇 1 包含重要的叶绿体发育相关基因GOLDEN2-LIKE1 ( SlGLK1 )和CHLOROPHYLL A/B BINDING PROTEIN11 ( SlCAB11 ) 、叶绿素生物合成基因CHLOROPHYLLIDE A OXYGENASE ( SlCAO)和PROTOCHLOROPHYLLIDE OXIDOREDUCTASE3 ( SlPOR3 ) ，以及光系统 II 蛋白编码基因PsbP DOMAIN-含有蛋白质 3 ( SlPsbP3 )，而簇 2 包括1-氨基环丙烷-1-羧酸( ACC ) OXIDASE1 (SlACO1 )、ACC SYNTHASE2 ( SlACS2 ) 和SlE8参与调节乙烯生物合成和信号传导 ，它们参与类胡萝卜素生物合成过程，它们可能会在果实成熟过程中改变细胞壁特性。
这些基因的表达也通过qRT-PCR进行了评估，证实了30dpa果实中SlGLK1、SlCAB11、SlCAO、SlPOR3和SlPsbP3的水平升高（图 5a），以及slmir164a CR相对于野生型 的果实在 35dpa 和 42dpa SlACO1、SlACS2、SlE8、SlZDS、SlPSY1和SlXTH3水平升高（图6a）。此外，所有 11 个基因在其启动子上都含有推定的 NACBS（图 S6 b；图 S7b)，这表明 SlNAM2/SlNAM3 可能直接结合这些基因并调节它们的转录。
为了验证这一假设，我们进行了 EMSA 实验以评估 SlNAM2 和 SlNAM3 与包含这些基因上推定的 NACBS 的启动子片段的直接相互作用。结果表明，SlNAM2 和 SlNAM3 能够结合所有 11 个启动子区域，并且 SlNAM2 或 SlNAM3 与每个生物素标记片段的结合可以通过过量的具有相同序列的未标记竞争 DNA 减弱（图 5b-c；图 6b -c )。我们还在本氏烟草的叶子中进行了双荧光素酶测定，并证明了 Sly-miR164 抗性形式的SlNAM2或SlNAM3 ( SlNAM2 m和SlNAM3 m ) 可以强烈诱导所有 11 个基因的启动子活性，尽管天然SlNAM2或SlNAM3的过表达未能这样做，这可能归因于本氏烟草miR164 的抑制（图 5d-h ; 图 6d-h )。这些结果表明，SlNAM2和SlNAM3可能作为SlMIR164A下游通路中这些重要的叶绿体发育和果实成熟相关基因的直接正调节因子。
3.5 SlNAM2/SlNAM3是SlMIR164A控制果实成熟和品质的主要效应子
SlNAM2 / SlNAM3直接激活叶绿体发育和果实成熟的关键调节因子支持了一个模型，即SlMIR164A可能通过SlNAM2 / SlNAM3控制番茄发育中的果实成熟和品质。为了进一步测试该模型，我们利用带有烟草脆裂病毒（TRV）载体的VIGS系统在野生型和slmir164a CR的果实成熟阶段特异性抑制SlNAM2 / SlNAM3的表达。我们还将 VIGS 应用于PHYTOENE DESATURASE ( SlPDS) 基因作为阳性对照，转化果实中的空 TRV 载体作为阴性对照。我们在野生型和slmir164a CR果实中检测到SlNAM2、SlNAM3或SlPDS的表达降低，这表明 VIGS 成功抑制了靶基因（图 7c）。我们还在野生型和接种TRV-SlPDS 的slmir164a CR果实中观察到大面积的漂白果皮组织（图 7a，b）。
根据这种视觉表型，TRV-SlPDS- 与阴性对照相比，受感染的果实从开花到开始成熟的间隔也更长，并且番茄红素含量降低（图 7d，e），这表明 VIGS 系统在我们的分析中的有效性。与SlPDS抑制对野生型和slmir164a CR果实的类似强烈影响不同，SlNAM2和SlNAM3的沉默似乎在这两种遗传背景中表现出不同的表型效应。具体来说，感染TRV-SlNAM2和TRV-SlNAM3的slmir164a CR果实与空 TRV 载体相比成熟晚，表现为从开花到开始成熟的时间延长，并且前者的果实番茄红素水平低于后者（图 7d，e）。一致地，在TRV-SlNAM2 slmir164a CR和TRV-SlNAM3 slmir164a CR的果实中，我们还检测到乙烯的产生减少以及乙烯生物合成和反应基因SlACO1、SlACS2和SlE8的表达，以及类胡萝卜素生物合成的转录减少调节器SlPSY1与阴性对照相比（图 7f，g）。
这些结果表明抑制SlNAM2或SlNAM3可以逆转由SlMIR164A功能丧失引起的早熟表型，这有力地支持了我们的模型，即SlMIR164A通过SlNAM2和SlNAM3影响番茄果实成熟。然而，我们没有注意到野生型果实在接种TRV-SlNAM2或TRV-SlNAM3后这些成熟相关参数有任何明显变化（图 7a、d、e），这可能是由于SlNAM2的低表达和野生型果实发育成熟阶段的 SlNAM3 （图S4F）。此外，我们还测量了TRV-SlNAM2 slmir164a CR、TRV-SlNAM3 slmir164a CR和阴性对照果实中葡萄糖、果糖和主要有机酸的含量。我们发现，与35dpa 的对照相比 ，这些化合物中的大多数在SlNAM2 - 或SlNAM3 - 沉默的水果中的丰度降低（图7h-o）。这表明抑制SlNAM2/SlNAM3也逆转了slmir164a CR在早熟期糖和有机酸代谢物的增加，从而影响slmir164a CR的品质。水果。总之，这些结果显示了SlNAM2和SlNAM3在果实成熟和品质调控中的先前未知作用，并证明这两个 NAC 基因是SlMIR164A在番茄果实发育成熟和品质控制中的主要效应物。
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结论
该研究揭示了SlMIR164A及其靶基因SlNAM2/SlNAM3在调控番茄果实成熟和品质中的重要功能。研究结果不仅为理解保守的MIR164基因家族在植物发育中的调控机制提供了新的见解，而且对于在番茄育种中的应用也具有潜在的意义。特别是因为SlMIR164A的丢失对器官形态发生的影响可以忽略不计，所以 SlMIR164A的操作活动可以帮助创造新的番茄突变体，这些突变体的果实成熟度和品质特征发生了改变，但整体生长正常。这些突变品种，尤其是具有重要商业价值的品种，可用于专门针对果实成熟和品质属性的育种计划，从而极大地促进番茄在田间的改良。
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原文获取
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13824
END
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