文章信息
题目：Solanaceous plants switch to cytokinin-mediated immunity against Ralstonia solanacearum under high temperature and high humidity
刊名：Plant, Cell & Environment
作者：Sheng Yang, Shuilin He et al.
单位：Fujian Agriculture and Forestry University
日期：14 November 2021
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摘要
植物病害通常在高温高湿（HTHH）条件下比在环境温度下更严重，但植物对高温高湿条件下病原体攻击的免疫力仍然难以捉摸。在此，我们以辣椒为例，通过RNA-seq结合反向遗传方法研究茄科如何应对HTHH下的青枯病菌感染（RSI）。结果表明，环境温度下RSI激活了辣椒根部水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）介导的免疫。然而，在 HTHH 下的 RSI 后，JA 信号被阻断，SA 信号被早期激活，但其持续时间在辣椒根中大大缩短，相反，CaIPT5的表达和谷胱甘肽 S-转移酶编码基因，以及反式玉米素的内源性含量得到增强。此外，通过在辣椒植物中基因沉默和在本氏烟草中过表达，发现CaIPT5在HTHH 下以与CaPRP1和CaMgst3相关的方式在对 RSI 的免疫反应中发挥积极作用。此外，辣椒、番茄和烟草在 HTHH 下对 RSI 的敏感性通过外源应用 tZ 显着降低，但 SA 或 MeJA 均未显着降低。所有这些数据共同表明辣椒利用细胞分裂素介导的免疫来应对 HTHH 下的 RSI。
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技术路线
03
主要结果
3.1 RSRT 和 RSHT 在不同的辣椒自交系中产生不同的效果
为了测试 HTHH 是否会影响辣椒对青枯病的抗性，我们用青枯菌接种 15 个辣椒自交系，然后将它们暴露于 RTHH（28ºC，空气湿度 >80%）和 HTHH（37ºC，空气湿度 >80 %）。由于较低的湿度不是青枯菌感染的适宜环境条件，为了避免引入湿度作为变量，使分析更加复杂，本研究以室温高湿（RTHH）作为控制高温高湿的环境条件。对照植物由暴露于HTHH但未接种青枯菌的相同辣椒自交系组成。我们观察到单独的 HTHH 处理不会对测试的辣椒系造成任何明显的损害。根据菌落形成单位 (cfu) 的数量，当暴露于高温 (RSHT) 与室温 (RSRT) 处理3天后（图 S1A 和 S1B）。一些接种品系在处理后 7 天后暴露于室温 (RSRT) 时表现出青枯病症状（图 S1C）。因此，这些结果表明，症状的严重程度是由于青枯菌接种和 HTHH 的组合效应，而不是单独的 HTHH。这些数据表明，青枯病抗性被 HTHH 减弱，这可能是茄科的普遍现象，因为本氏烟草或番茄 (Solanum lycopersicum) 植物对青枯菌接种的抗性同样受到 HTHH 的损害（图 S2）。然而，与大多数辣椒品系不同，192-3 和 GZN13-42 在 RTHH 下比在 HTHH 下更容易感染 RS。这一结果表明辣椒对青枯菌的免疫在 HTHH 下可能与在 RTHH 下不同。
3.2 由 RSHT 激活的编码 PR 蛋白的基因与在辣椒根中由 RSRT 激活的基因在很大程度上不同
为了确定在受到 RSHT 攻击和通过 RSRT 处理的辣椒植物之间差异表达的一组基因，分析了来自 TT5203 的植物根的转录组（更容易受到RSHT）和 HN42（对 RSHT 的敏感性较低）辣椒自交系受到 RSRT 和 RSHT 处理的反应。
我们专注于根转录组，因为青枯菌仅通过该组织侵入辣椒植物。在将幼苗浸入青枯菌细胞溶液（OD600 = 0.6）之前，我们机械损坏了幼苗的根部，然后将它们置于 HTHH 或 RTHH 条件下。为了消除可能的变异来源，我们分别在 48 和 90 hpt（处理后小时）收集 RSHT 和 RSRT 处理的样品（辣椒植物的根），因为 RSHT 处理的 HN42 植物在 48 hpt 表现出相似的青枯病症状（疾病指数大约为 1.0)(图 1A)。在 48 和 90 hpt 检测到 HN42 和 TT5203 中 RSHT（使用 HTHH 处理作为对照）和 RSRT（使用 RTHH 处理作为对照）之间的差异表达基因 (DEGs)，更加关注 RSHT 处理的 HN42 中的免疫相关 DEG，因为它是对 RSHT 的敏感性较低。总共从 12 个文库中获得了大约 17.8 亿条reads。对于 HN42-RTHH、48 hpt 的 RSRT、HTHH 和 RSHT 以及 90 hpt 的 HN42-RTHH、RSRT 的 RNA-seq，平均获得了 6891 万条reads，其中 82.66% 被唯一地映射到辣椒参考基因组上。
DEG 分析的结果表明，在RTHH 和 RSRT 在 90 hpt 处理时，在 HN42 和 TT5203 中分别鉴定出 3020 和 4891 个 DEG，但在 48 hpt 时，HN42 和 TT5203 中分别仅发现 11 和 10 个 DEG。在 48 hpt 处理 HTHH 和 RSHT 之间，在 HN42 中鉴定出 1638 个 DEG，但在 TT5203 中仅鉴定出 58 个（图 1B 和表 1），表明 TT5203 对 RSHT 几乎没有反应，也没有启动有效的防御反应。
两个测试品系的植物在 90 hpt 时被 RSHT 严重破坏，我们未能提取任何 RNA 用于文库构建。基于聚类分析，RSRT处理植物的转录组与RTHH处理植物的转录组表现出强相关性，而RSHT处理植物的转录组与HTHH处理植物的转录组表现出高度相关性（图1C），表明转录重编程在RSHT处理的HN42和HTHH处理的HN42植物中可能同时发生，HTHH对转录重编程的影响远大于RSHT。通过维恩图，我们在 RTHH 和 RSRT 处理之间分别确定了 HN42 和 TT5203 中的 1688 和 1779 个 DEG，其中 HN42 中的 351 个上调，而 TT5203 中的 1168 个上调，而 HN42 中的 692 个和 TT5203 中的 1866 个下调。
在GO数据库中分析了所有的DEGs，结果表明，与RTHH处理相比，两个受试辣椒品系中RSRT上调的DEGs主要富集在应激反应等过程[GO:0080134]，防御反应 [GO:0006952]、次级代谢过程 [GO:0019748] 和氧化应激反应 [GO:0006979]。另一方面，两个测试品系中 RSRT 下调的 DEG 主要富集在生长 [GO:0040007]、生长素反应 [GO:0009733]、生殖结构发育 [GO:0048608]、种子发育 [GO:0048608] 等过程中。
Fig. 1
3.3 CaMgst3 和 CaPRP1 在辣椒对 RSHT 的反应中起调节作用
为了测试第 II 组或第 III 组中的 GST 是否在辣椒对 RSHT 的免疫中发挥作用，我们以 CaMgst3 和 CaPRP1 为例，它们在 HN42 中对 RSHT 有特异性反应，属于 III 组（图 5A），并测量了它们的转录本在其他受 RSRT 或 RSHT 攻击的辣椒品系植物中的水平（图 S1），结果表明测试品系中的这些基因都被 RSHT 特异性上调，具有高水平 RSHT 抗性的品系表现出更高水平的 CaMgst3 和 CaPRP1 转录本, 虽然 RSHT 易感品系表现出较低水平的 CaMgst3 和 CaPRP1 转录本 (图 5B), 这表明在 RSHT 上 CaMgst3 和 CaPRP1 的特异性上调是各种辣椒品系的普遍现象, 辣椒对 RSHT 的防御反应可能不同于RSRT。由于 CaMgst3 和 CaPRP1 被 RSHT 特异性上调，因此通过 VIGS 通过基因沉默测定了它们在该过程中的作用，结果表明 CaMgst3 或 CaPRP1 沉默的辣椒对 RSHT 处理的敏感性增强，但对 RSRT 处理不敏感，表明这两个基因特异性地作为辣椒对 RSHT 免疫的正调节因子（图 5C、5D 和 5E）。
Fig. 5
3.4 RSHT 和 RSRT 处理导致辣椒中激素和激素生物合成基因转录物的积累
由于植物对病原体的防御反应通常受植物激素的调节，我们检查了 RNA-seq 数据集中植物激素生物合成基因的转录水平，以研究它们可能参与辣椒对 RSHT 处理的反应。在两个测试的近交系中，JA 生物合成基因 LINOLEATE 9S-LIPOXYGENASE (LOX1) (Spoel et al., 2003) 和 SA 生物合成基因 ISOCHORISMATE SYNTHASE1 (ICS1) (Attaran, Zeier, Griebel, & Zeier, 2009) 的转录水平高度上调。通过 RSRT 处理，但通过 RSHT 处理下调。
相比之下，编码 ABA 和 CK 生物合成酶的基因，例如 9-cis-EPOXYCAROTENOID DIOXYGENASE1(NCED1)、NCED5 (Frey et al., 2012)、ISOPENTENYL TRANSFERASE2(IPT2) (Sakakibara, 2005)、IPT5 和 IPT9 ，在很大程度上被 RSRT 下调，但通过 RSHT 治疗高度上调（图 2A 和 2B）。这些数据表明，SA、JA、ABA 和 CK 的生物合成受到 RSHT 和 RSRT 处理的不同调节。
为了证实这一假设，我们在 3、9、24 和 48 hpt 时测量了受 RSRT 和 RSHT 处理攻击的 HN42 植物根中内源 SA、JA、ABA 和 CK 的水平。在处理后 3 小时和 9 小时 (hpt)，RSHT 攻击的辣椒植物的所有植物激素的含量均显着低于 RSRT 植物，但玉米素、tZ、ABA 和 SA 除外。在所有测试时间点，HN42 系辣椒根中 ABA 的含量均显着高于对照植物，而 RSHT 处理的辣椒根中 tZ 的含量是最活跃的 CK 之一。从 9 到 48 hpi，这两个测试系显着高于对照植物的根系（图 2C）。值得注意的是，两个测试品系的 HTHH 攻击辣椒植物根部中较高水平的 ABA 含量表明，用 RSHT 攻击的辣椒植物根中高水平的 ABA 可能是由 HTHH 引起的，而不是由青枯菌感染引起的。所有这些数据表明，辣椒植物根部的 JA 和 SA 的生物合成受到抑制，而 ABA 和 CKs 的生物合成被 RSHT 激活。
Fig. 2
3.5 CaIPT5 和细胞分裂素在辣椒对 RSHT 处理的反应中发挥积极作用
用 RSHT 处理的辣椒根中 CaIPT5 转录物水平的增加和 tZ 的积累表明细胞分裂素的参与是对 RSHT 反应的一部分。为了检验这一假设，我们评估了 CaIPT5 和 tZ 在辣椒对 RSHT 治疗的反应中的作用。通过病毒诱导基因沉默 (VIGS) 沉默 CaIPT5 显着降低了辣椒植物的抗性（图 3D、3E 和 3F），而 CaIPT5 的过表达增强了本氏烟草植物对 RSHT 处理的抗性（图 3A、3B 和 3C） ）。与这些结果一致，特定的 RSHT 响应基因 CaMgst3 和 CaPRP1（仅在 HN42 中被 RSHT 上调）在辣椒植物中通过 CaIPT5 的沉默显着降低，并且在本氏烟草植物中 CaIPT5 的过表达诱导了它们的直系同源物 NbMgst3 和RSHT 处理下的 NbPRP1。相比之下，特定的 RSRT 响应基因 CaSTH2 和 CaDEF1（仅通过 RSRT 上调）不会因 CaIPT5 的沉默而下调。同样，CaIPT5 在本氏烟草植物中的过表达不影响直系同源物 NbSTH2 和 NbDEF1 的表达（图 S6A 和 S6B）。此外，CaIPT5 的沉默显着降低了辣椒植物根部中 tZ 的积累（图 S7），表明 CaIPT5 的激活导致的较高 tZ 水平可能在辣椒对 RSHT 处理的反应中发挥作用。
Fig. 3
为了验证这一假设，我们分析了外源施用 tZ、KT 和 6-BA 对辣椒植物对 RSRT 或 RSHT 处理的反应的影响。外源应用 tZ 显着增强了辣椒对 RSHT 处理的抗性，这伴随着 CaMgst3 和 CaPRP1 的上调以及 CaSTH2 和 CaIPT5 的下调，而 CaDEF1 转录水平没有变化（图 4A、4B 和 4C）。
重要的是，外源施用 tZ 还显着增强了番茄和烟草植物对 RSHT 处理的抗性，而外源施用 SA 或 JA 均未增强受试植物对 RSHT 处理（34 至 37ºC，90% 湿度）的耐受性。这些结果表明，由 CK 介导的信号传导可作为受试茄科植物（包括辣椒）对 RSHT 处理耐受性的正调节因子，而由 SA 信号传导和 JA 信号传导介导的植物免疫可能不参与调节茄科对 RSHT 处理的反应
Fig. 4
3.6 CaMgst3和CaPRP1是RSHT修饰染色质或tZ联合青枯菌感染
为了测定 tZ 是否通过上调 CaMgst3 和 CaPRP1 也以染色质重塑依赖性方式在辣椒对 RSHT 处理的反应中发挥积极作用，我们首先研究了 RSHT 处理对 CaMgst3 和 CaPRP1 染色质重塑的影响，然后分析了 tZ 在此中的潜在作用过程。通过测量活性染色质相关 H3K4me3 和非活性染色质相关 H3K9me2 的沉积来确定染色质重塑。我们从用 RTHH、RSRT、HTHH 或 RSHT 攻击的 HN42 植物的根中提取染色质。超声破碎染色质，用H3K4me3或H3K9me2抗体进行免疫沉淀，提取DNA并纯化备用。基于基因序列，我们设计了围绕 CaMgst3、CaPRP1、CaSTH2 或 CaDEF1 转录起始位点的 100 bps 片段的引物（表 S1），并进行 ChIP-PCR 和 ChIP-qPCR 检测在测试基因的转录起始位点周围富集 H3K4me3 和 H3K9me2。
我们的结果表明，在 RSHT 处理后，或当用 tZ 处理并接种青枯菌时，CaMgst3 和 CaPRP1 基因座在其转录起始位点 (TSS) 内表现出高水平的 H3K4me3 和低水平的 H3K9me2 沉积（图 6A 和 6B ），而在 RSRT 处理后，CaSTH2 和 CaDEF1 在其 TSS 中显示出高水平的 H3K4me3 但低水平的 H3K9me2 沉积（图 6A 和 6B），表明染色质激活和失活参与了 RSHT 和 CaMgst3 和 CaPRP1 的差异激活和RSRT 治疗。我们还确定，在 CaMgst3 或 CaPRP1 的 TSS 内，将 tZ 外源应用于接种青枯菌的植物模拟 RSHT 处理，因为它降低了 H3K9me2 的富集，并增强了 H3K4me3 的富集，并增强了 H3K9me2 并减少了 H3K4me3 沉积到CaSTH2 和 CaDEF1 的 TSS 或启动子（图 6C）。这些结果表明，辣椒植物被激发以激活 RSHT 响应性 PR 基因，但也通过 CK 信号传导在 RSHT 处理后使 RSRT 响应性 PR 基因失活。
Fig. 6
04
结论
茄科植物经常遭受由土壤传播的病原体引起的疾病，包括青枯菌。尽管 HTHH 治疗总是使与疾病相关的症状恶化（Koeda 等人，2012；F. Zhou 等人，2004），但茄科如何应对青枯菌感染和高温（RSHT 治疗）的组合仍然存在不足。进行了调查。在这里，我们证明辣椒植物对 RSHT 处理的反应不同于对 RSRT 处理的反应，细胞分裂素介导的免疫在 HTHH 下辣椒植物对青枯菌感染的反应中起重要作用
4.1 辣椒对 RSHT 和 RSRT 治疗的免疫反应是不同的
4.2 Pepper 利用细胞分裂素信号介导的免疫来应对 HTHH 下的青枯病
4.3 细胞分裂素通过染色质重塑调节免疫反应
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原文获取
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pce.14222
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