文章信息
题目：Pepper SUMO E3 ligase CaDSIZ1 enhances drought tolerance by stabilizing the transcription factor CaDRHB1
刊名：New Phytologist
作者：Hyunhee Joo,Chae Woo Lim,Sung Chul Lee
单位：Chung-Ang University，Korea
日期：07 June 2022
摘要
1
小泛素样修饰剂 (SUMO) 共轭 (SUMOylation) 是一种与蛋白质稳定性和活性相关的可逆翻译后修饰，可调节植物中的激素信号传导和应激反应。以前，我们报道了辣椒脱水响应同源框域转录因子 CaDRHB1 作为干旱响应的正调节剂。
在这里，我们发现 SUMO E3 连接酶Capsicum annuum DRHB1 与 SAP 和 Miz 结构域 (SIZ1) (CaDSIZ1) 介导的 SUMO 化响应干旱增强了 CaDRHB1 蛋白的稳定性，从而正向调节脱落酸 (ABA) 信号传导和干旱响应。用精氨酸取代 CaDRHB1 的赖氨酸 (K) 138 可减少 CaDSIZ1 介导的 SUMO 化，表明 K138 是 SUMO 缀合的主要位点。
病毒诱导的CaDSIZ1沉默促进了 CaDRHB1 的降解，表明 CaDSIZ1 参与了干旱诱导的 CaDRHB1 的 SUMO 化。CaDSIZ1 与 CaDRHB1 相互作用并促进了 SUMO 结合。CaDRHB1，主要定位于细胞核，但也在细胞质中处于SUMO化模拟状态，表明CaDRHB1的SUMO化促进其核输出，导致细胞质积累。
此外，CaDSIZ1沉默的辣椒植物对 ABA 不敏感，对干旱胁迫相当敏感，而CaDSIZ1过表达植物表现出 ABA 超敏感和耐旱表型。总的来说，我们的数据表明 CaDSIZ1 介导的 CaDRHB1 的 SUMO 化在 ABA 介导的耐旱性中起作用。
技术路线
2
辣椒植株在27±1°C的生长室中以16小时光照/8小时黑暗周期生长。
辣椒SUMO途径成分的鉴定
总RNA提取和RT-PCR
全部SUMO偶联物的体内分析
病毒诱导的基因沉默
主要结果
3
3.1 干旱胁迫和外源ABA增强了CaDRHB1的稳定性
许多转录因子，包括HD-ZIP和bZIP，在植物对激素和环境刺激的反应过程中被发现发生翻译后修饰。在之前的研究中，我们证明了HD-ZIP I亚家族成员CaDRHB1通过ABA介导的气孔关闭作为抗旱性的积极调节剂发挥作用。基于这些观察，我们推测CaDRHB1蛋白的稳定性是否受到辣椒植物干旱反应中翻译后修饰的调节。为了评估这种机制的可行性，我们首先使用从遭受干旱胁迫和ABA处理6小时的辣椒植株中获得的粗叶提取物，对谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记的CaDRHB1蛋白进行了无细胞降解试验（图1）。相对于不受GST标记影响的对照植物，我们发现干旱胁迫辣椒植物的粗提物中CaDRHB1降解延迟（图1a）。用ABA处理的辣椒植株粗提物中也观察到类似的模式（图1b），但用250 mM NaCl处理的辣椒植物粗提物则没有观察到类似模式（图S1）。这些结果表明，干旱胁迫和ABA响应因子可能会增强CaDRHB1的稳定性
Fig. 1
3.2 干旱胁迫促进CaDRHB1的SUMO化并抑制蛋白质降解
在HD-ZIP亚家族成员中，许多属于I、II、V组和Pp组的蛋白质（来自Physcommitrella patens）被发现含有SUMO酰化的保守基序ΨKXE/D（其中Ψ是一个大的疏水残基，X是任何氨基酸）。我们同样观察到，两个假定的基序，LKKE（119至122）和MKKD（137至140），分别存在于CaDRHB1的同源盒相关亮氨酸拉链结构域及其附近（图2a）。我们假设，为了应对干旱胁迫和ABA，CaDRHB1蛋白的SUMO酸化可以抑制蛋白质降解。为了验证这一假设，我们进行了体内SUMO酸化试验，以检查干旱胁迫是否会诱导CaDRHB1的SUMO化。从共同表达Pro35S:CaDRHB1-GFPandPro35S:HA-CaSUMO1的烟草植物脱水叶片中提取蛋白质，并进行免疫印迹分析。如图2b所示，干旱胁迫促进了CaDRHB1蛋白的SUMO酸化。
我们进行了无细胞降解试验，以检查SUMO化是否影响CaDRHB1的稳定性。为了模拟CaDRHBl的sumoylated状态，CaDRHB1C末端区域与SUMO蛋白序列融合，正如之前的研究所示。通过重叠延伸PCR产生SUMO酸化模拟物CaDRHB1（CaDRHB1-SUMO1）融合基因。与完整的CaDRHB1和SUMO1单独降解相比，CaDRHB1-SUMO1蛋白的降解相对受到抑制。总之，这些发现表明干旱诱导的CaDRHB1的SUMO化增加了该蛋白的稳定性。
Fig. 2
3.3 赖氨酸残基138对CaDRHB1的SUMO化至关重要
为了确定CaDRHB1 SUMOylization的位点，根据其保守结构域和基序，将蛋白质分为五个片段。其中，第三个片段（F3:94至147）包含两个SUMO酸化的假定基序，因此我们预测CaDRHB1的F3区域可能是SUMO化的靶区。
为了证实这一假设，我们用HAtagged CaSUMO1在本氏烟植物的叶片中瞬时共表达了相应的五个GFP标记的CaDRHB1片段。用抗HA抗体免疫沉淀叶蛋白，然后用抗GFP抗体进行免疫印迹分析。因此，我们从CaDRHB1的F3片段检测到一个强信号（图3a）。通过表达Pro35S:HACaSUMO1ΔGG（一种用作阴性对照的非共轭SUMO蛋白）未观察到这种SUMO结合，因此表明SUMO1蛋白不会通过非共价相互作用与CaDRHB1结合。已确定位于ΨKXE/D共有序列中的赖氨酸残基对SUMOylation至关重要，尽管非共有序列的赖氨酸残基也约占所有SUMOylations的20%–25%。CaDRHB1的F3片段序列包含九个赖氨酸（K）残基，每个残基都被精氨酸（R）取代，以确定CaDRHB1protein中SUMOylization的精确位置。HA标记的CaSUMO1与CaDRHB1 F3的氨基酸替代突变体的共表达表明，CaDRHB1F3K138R中的SUMO结合显著低于完整的CaDRHBl（图3b）。相比之下，其他突变体，包括第一共有基序中的K120R和K121R，显示出与完整CaDRHB1相似的SUMO接合（图3b，S2）。
我们进一步研究了CaDRHB1中赖氨酸138的氨基酸替代是否会影响干旱胁迫下蛋白质的稳定性。使用GST标记的CaDRHB1K138R和CaDRHB1 K120R蛋白进行的无细胞降解试验表明，与完整的CaDRHB1相比，当与遭受干旱胁迫的辣椒植株的粗叶提取物培养时，CaDRHB 1K138r蛋白的降解增强（图1a、3c和3d）。就CaDRHB1K120R蛋白而言，我们发现干旱胁迫并不影响蛋白质稳定性，因此表明赖氨酸120可能在CaDRHB1的SUMO酸化中起部分作用。因此，这些观察结果表明赖氨酸残基138是CaDRHBl SUMO化的重要位点，因此，在干旱胁迫下调节CaDRHB蛋白的稳定性。
Fig. 3
3.4 CaDRHB1蛋白的稳定性是通过沉默SUMO E3连接酶CaDSIZ1而不是MMS21来调节的，CaDSIZ1不能恢复拟南芥siz1突变体的矮秆表型
为了研究CaDRHB1被SUMO化并增强其干旱响应稳定性的详细机制，我们试图确定CaDRHBl的SUMO途径成分。我们最初关注的是SUMO E3连接酶，它可以通过蛋白质-蛋白质相互作用域直接与靶蛋白相互作用，并分离出两种辣椒SUMO E连接酶CaDSIZ1和CaMMS21，分别与AtSIZ1和AtMMS21具有高度序列同源性。
为了分析辣椒SUMO E3连接酶在CaDRHB1 SUMO化中的功能参与，我们使用来自CaDSIZ1沉默（TRV2:CaDSIZ1）或CaMMS21沉默（TRV2:CaMMS1）辣椒植物的粗叶提取物进行了无细胞降解试验（图4a，S4a（见下文））。在进行无细胞降解试验之前，进行半定量RT-PCR分析，以确认每个基因的沉默（图S3）。与对照植物（TRV2:00）相比，在所有评估时间点，TRV2:CaDSIZ1中的GST-CaDRHB1降解都显著促进。特别是，我们观察到，尽管培养2小时后，<42%的CaDRHB1蛋白在TRV2:00中降解，但只有约23%的TRV2:CaDSIZ1蛋白保持完整（图4a）。与CaDSIZ1沉默相比，CaMMS21沉默似乎对GST-CaDRHB1降解没有明显影响（图S4a）。
此外，我们检测到干旱处理对CaDSIZ1转录表达的逐渐诱导，而不是CaMMS21转录表达（图S4b）。这些结果表明，CaDSIZ1可以作为推测的SUMO E3连接酶，有助于调节CaDRHB1蛋白的稳定性。为了更深入地了解CaDSIZ1的生物学功能，我们基于定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）分析，检测了2周龄辣椒幼苗和5周龄辣椒植株不同器官中CaDSIZ的表达水平（图4b）。我们观察到CaDSIZ1基因在所有评估器官中都有表达，在花和绿色水果中的表达水平要高得多。
随后，我们研究了CaDSIZ1的亚细胞定位。当在红花菜叶片中瞬时表达时，发现GFP标记的CaDSIZ蛋白定位于细胞核中（图4c）。考虑到干旱胁迫显著诱导了CaDSIZ1在叶片中的表达（图S4b），我们进一步分析了胁迫条件下辣椒叶片中CaDSIZ1的表达模式。如图4d所示，在用20%PEG处理后，CaDSIZ1逐渐被诱导，表达水平在6小时达到最大值。用100μM ABA处理9小时后，也显著诱导CaDSIZ1表达，而在NaCl处理的辣椒植株中，CaDSI表达在6小时达到峰值，随后逐渐下降。相反，低温胁迫促进了CaDSIZ1在6小时后的表达显著减少。与CaDSIZ1一样，CaDRHB1主要定位于细胞核，其表达由非生物胁迫和ABA诱导。这些观察结果表明，CaDSIZ1可能与植物对非生物胁迫的反应中的CaDRHB1有关。
CaDSIZ1序列与AtSIZ1序列具有57%的同一性和75%的相似性，并包含多个SUMOylations保守域，包括植物同源域（PHD）和SIZ1/PIAS（SP）-RING。我们推测CaDSIZ1是否可能与蛋白SUMO化有关，并据此检测了CaDSIZ沉默和CaDSIZ1过度表达的辣椒植株中的全局蛋白SUMO1化水平。为了检测SUMO结合蛋白，使用抗SUMO1抗体进行免疫印迹分析，结果显示CaDSIZ1表达水平与全局SUMO酸化强度之间存在正相关（图4e，f）。这些数据表明CaDSIZ1可以作为活性SUMO E3连接酶发挥作用。建立了这种假定的联系后，我们试图确定CaDSIZ1是否可以弥补AtSIZ1功能的丧失。然而，虽然功能丧失的siz1突变体显示出矮化表型，但我们发现具有siz1背景的拟南芥植物中CaDSIZ1的过度表达没有明显的表型差异（图S6），Pro35S:CaDSIZ1/siz1-3突变体与两个检测的size1植物系的表型相似，siz1-3（CS6560）和siz1-5（SALK_111280）（图S6b）。此外，与野生型相比，siz1植物在逆境处理中没有表现出强烈的蛋白SUMO化诱导（图S6c），在Pro35S:CaDSIZ1/siz1-3突变体中也观察到类似的模式。这些发现可能表明，作为SUMO E3连接酶，CaDSIZ1的功能可能与AtSIZ1不同。
Fig. 4
3.5 CaDSIZ1与CaDRHB1存在物理上的互作
鉴于我们的发现，辣椒植株中CaDSIZ1的沉默会影响CaDRHB1蛋白的稳定性（图4a），我们假设CaDSIZ1可以介导作为目标蛋白的CaDRHBl的SUMO酸化。为了确定CaDSIZ1是否与CaDRHB1直接相互作用以实现SUMO酸化，我们在体内外检测了这两种蛋白之间的相互作用。纯化重组蛋白的下拉分析显示，GST-CaDSIZ1与MBP-CaDRHB1结合，而GST和MBP分别与MBP-CaDRHB1和GST-CaDS IZ1结合（图5a）。
我们进一步研究了CaDSIZ1和CaDRHB1在体内的相互作用，方法是在本本氏烟叶片中瞬时表达这两种蛋白。共免疫沉淀分析显示，CaDRHB1 GFP（尽管不是GFP）通过抗HA琼脂糖珠在HA-CaDSIZ1/CaDRHB1-GFP的总蛋白中进行免疫沉淀（图5b），这也通过分裂荧光素酶互补分析进行了验证（图5c）。
此外，在双分子荧光互补分析中，仅在共表达CaDSIZ1和CaDRHB1的植物细胞核中观察到黄色荧光蛋白信号（图5d）。与CaDSIZ1相互作用相反，我们在红木樨叶片中检测到CaDRHB1和SUMO E3连接酶CaMMS21之间没有相互作用（图S4c）。因此，这些观察结果提供了证据，表明CaDSIZ1以核定位CaDRHB1蛋白为靶点，可能用于随后的SUMO酸化。
Fig. 5
3.6 CaDSIZ1介导的CaDRHB1蛋白的SUMO酸化
在建立了CaDSIZ1和CaDRHB1之间的相互作用后，我们继续进行体外SUMO酸化试验，以确定CaDSIZ1是否介导CaDRHBl的SUMO化，其中MBP-CaDRHB与不同量的GST-CaDSIZ在SUMO途径成分的存在下共孵育，包括SUMO激活酶E1（CaSAE1和CaSAE2）、SUMO结合酶E2（CaSCE1）和CaSUMO1（图6a）。
使用抗MBP抗体的免疫印迹分析显示，与SUMO结合的MBP-CaDRHB1对应的蛋白信号随着GST-CaDSIZ1数量的增加而增强。相比之下，在GSTCaDSIZl和MBP蛋白单独共同孵育后，很少检测到SUMO接合形式。此外，为了在体内验证CaDSIZ1介导的CaDRHB1的SUMO化，我们使用暂时表达Pro35S:HA-CaDSIZl、Pro35S:CaDRHB1-GFP和Pro35S:HA-CaSUMO1的本哈米纳链球菌进行SUMO酸化分析（图6b）。作为SUMOylation突变体，我们使用Pro35S:CaDRHB1K120138R GFPor Pro35S:CaDSIZ1C379S/H381Y（CaDSIZ1 SP-RING域突变体）。使用GFP陷阱免疫沉淀叶蛋白，并进行免疫印迹分析。因此，我们观察到CaDRHB1与CaDSIZ1的共表达导致了高分子量信号和相对较强的蛋白质信号，对应于SUMO结合的CaDRHBl和GFP标记的CaDRHB1。甚至在GFP标记CaDRHB的输入样本中也观察到类似的模式。
此外，我们在样本中检测到类似的CaDRHB1转录水平，从而表明CaDRHBl蛋白水平由翻译后修饰控制。综上所述，这些结果表明CaDRHB1蛋白通过CaDSIZ1介导的SUMO酸化而稳定。
Fig. 6
3.7 CaDRHB1的SUMO化增强蛋白质稳定性
除蛋白质稳定性外，SUMO酸化也会影响蛋白质的亚细胞定位，因此，我们试图检查SUMO化是否影响CaDRHB1蛋白质的亚胞定位。在我们之前的研究中，我们确定CaDRHB1 GFP主要是核定位的，在细胞质中检测到的不到10%。相反，观察到SUMO酸化模拟CaDRHB1-SUMO1-GFP蛋白在烟草叶片的细胞质和细胞核中均匀表达（图7a）。基于这些观察结果，我们思考了SUMO酸化可能促进CaDRHB1蛋白的核输出和/或抑制这种蛋白降解的可能性，特别是在细胞质中。
为了验证这一推测，我们首先用核输出抑制剂钩端霉素B（LMB）处理表达CaDRHB1-SUMO1-GFP的烟叶12小时。与未处理的样品相比，LMB的应用被发现分别促进细胞核和细胞质中相对信号强度的增加和减少（图7b，c），在核-细胞质分馏实验中也一致观察到这种现象（图7d，e）。
我们继续研究SUMO酸化是否影响CaDRHB1蛋白的稳定性。为了抑制蛋白酶体降解，我们用50μM MG132渗透表达Pro35S:CaDRHB1-GFP的烟叶。12小时培养后进行的共聚焦显微镜分析显示，GFP信号分布在MG132处理的烟叶的细胞核和细胞质中，但仅分布在未处理烟叶的细胞核中（图7f），提示CaDRHB1蛋白可能发生细胞质降解。
为了确定这种细胞质降解与SUMO酸化之间的关联，我们在相同的上述条件下检测了SUMO化突变体CaDRHB1K120138R-GFP的亚细胞定位。与完整的CaDRHB1相比，我们发现MG132处理并未促进CaDRHB1K120138R GFP的强细胞质表达。在确定CaDSIZ1介导CaDRHB1蛋白的SUMO化后（图6），我们推测CaDSIZ1可能促进CaDRHBl的核输出。
为了表征CaDSIze1在这方面的功能参与，我们在本氏烟的叶片中与Pro35S:CaDSIQ1 GFP或Pro35S:CaDSIZ C379S/H381Y-GFP共同表达了Pro35S:0FP-CaDRHB1。尽管发现完整的CaDSIZ1 GFP表达可导致RFP-CaDRHB1蛋白的核定位和细胞质定位，但CaDSIQ1C379S/H381Y-GFP的表达没有（图7g），因此表明CaDSIZ1可以介导CaDRHBl蛋白的SUMO化，导致其核输出。用于调查核出口的共聚焦显微镜实验一式三份（复制品如图S7所示）。总之，这些观察结果表明，CaDSIZ1介导的CaDRHB1的SUMO化不仅可以诱导其核输出，还可以增强细胞质中蛋白质的稳定性。
Fig. 7
3.8 CaDSIZ1沉默辣椒植株对干旱胁迫的敏感性增加
我们之前的研究结果表明，CaDRHB1基因沉默会降低辣椒植株的抗旱性，因此，我们推测CaDSIZ1沉默会导致CaDRHBl蛋白稳定性降低，从而对耐旱性产生负面影响。为了证实这一点，我们使用CaDSIZ1沉默（TRV2:CaDSIZ1）和CaDRHB1-沉默（TRV2:CaDRHB1）辣椒植物检查了CaDSIQ1在干旱响应中的生物学功能（图8）。
用TRV2:CaDSIZ1、TRV2:CaDRHB1和TRV2:00（作为对照）转化的4周龄辣椒植株由于不浇水而遭受干旱胁迫。16天后，所有品系表现出相同的表型（图8a）。然而，TRV2:CaDSIZ1和TRV2:CaDRHB1植物在处理后比TRV2:00植物更显枯萎（图8a）。与TRV2:00（71.4%）植物相比，TRV2:CaDSIZ1（25.0%）和TRV2:CaDRHB1（30.0%）植物在复水第一天后的存活率明显较低（图8a）。
通过测量离体叶片的鲜重确定的蒸腾失水量，发现TRV2:CaDSIZ1和TRV2:CaDRHB1植物的蒸腾失水量明显高于TRV2:00植物（图8b）。在这种情况下，我们随后通过测量叶片表面温度和气孔孔径来研究这些植物的ABA敏感性（图8c-f）。然而，在没有ABA的情况下，我们检测到对照和基因沉默辣椒株系的叶片温度没有显著差异，在50µM ABA处理后，发现TRV2:CaDSIZ1和TRV2:CaDRHB1植株的叶片温度显著低于对照植株（图8c，d），从而表明TRV2:CaDSIZ1和TRV2:CaDRHB1植物的叶片蒸发冷却相对增加。
此外，为了确定这种现象是否与ABA诱导的气孔关闭改变有关，我们进行了气孔孔径生物测定（图8e，f）。因此，这表明，尽管在没有ABA的情况下，三种植物品系之间没有显著差异，但在有ABA的条件下，TRV2:CaDSIZ1和TRV2:caDRHB1的气孔大小显著大于TRV2:00植物的气孔大小。我们还基于qRT PCR分析了TRV2:CaDSIZ1、TRV2:CaDRHB1和TRV2:00辣椒植株中胁迫响应基因的表达模式，结果表明，TRV2:CADSIZ2和TRV2:CalDRHB1植株中干旱诱导标记基因CaOSR1、CaRAB18和CaLOX1的表达水平显著低于TRV2:00植株（图8g）。
这些发现表明，与CaDRHB1一样，CaDSIZ1通过调节蒸腾失水、ABA诱导气孔关闭和胁迫相关基因诱导，在抗旱性中发挥积极作用。
Fig. 8
结论
4
我们的结果表明，CaDSIZ1促进了CaDRHB1的SUMO化，增强了该转录因子的稳定性，从而调节ABA信号和干旱反应。
获取原文
5
原文链接：https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/nph.18300
PDF获取：
https://www.scientsgene.com/h-nd-112.html#_np=107_423
文末附件
END
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