文章信息
题目：Transcription factor CmbHLH16 regulates petal anthocyanin homeostasis under different lights in Chrysanthemum
刊名：Plant Physiology
作者：Li-Jie Zhou，Fadi Chen et al.
单位：Nanjing Agricultural University
日期：25 July 2022
01
摘要
光对植物生存至关重要，并在不同的光照条件下引发广泛的植物发育和生理反应。低红光与远红光 (R/FR) 光比可诱导避荫反应，包括减少花青素积累，而高 R/FR 光比可促进花青素生物合成。然而，支持不同 R/FR 光比如何调节花青素稳态的详细分子机制仍然难以捉摸，尤其是在非模型物种中。在这里，我们证明了低 R/FR 光比诱导CmMYB4的表达，从而抑制花青素激活剂复合物 CmMYB6-CmbHLH2，从而减少菊花中花青素的积累 ( Chrysanthemum morifolium) 花瓣。具体来说，CmMYB4 招募辅助抑制因子 CmTPL (TOPLESS) 直接结合CmbHLH2启动子，并通过削弱组蛋白 H3 乙酰化来抑制其转录。此外，低 R/FR 光比抑制了 PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 家族转录因子CmbHLH16，它可以竞争性结合 CmMYB4 并使 CmMYB4-CmTPL 蛋白复合物不稳定。在高R/FR光比下，CmbHLH16上调，阻碍了CmMYB4-CmTPL复合物的形成，解除了对CmbHLH2的抑制，从而促进了菊花花瓣中花青素的积累。我们的研究结果揭示了一种机制，通过该机制，不同的 R/FR 光比可以微调花瓣中的花青素稳态。
02
技术路线
Chrysanthemum (C. morifolium) cultivar “Nannong Fencui”
Vector construction and genetic transformation
RT-qPCR
Yeast libraries construction
Y1H assay
Y2H assay
Y3H assay
In vitro pull-down assay
BiFC
Anthocyanin content measurement
EMSA
ChIP-PCR
03
主要结果
3.1 低R/FR比光通过调节多个花青素相关结构基因抑制花青素生物合成，高R/FR光促进花青素合成
最佳光照条件对于植物达到最大生长潜力并确保其繁殖成功至关重要。许多植物对光照条件表现出快速反应，并能相应地调节生理以适应不断变化的环境。在直射阳光下，R/FR光照比高于1，而在深阴影下，其光照比可能降至0.1以下。
为了测试菊花是否对不同的光照条件有反应，在出芽阶段，菊花“南农粉翠”品种在白光（WL）（R/FR光照比约为1.09）、低R/FR光线比（约0.22）或高R/FR灯光比（约7.18）条件下处理（补充图S1A）。开花后，发现在低R/FR光照比下，其射线花瓣积累的花青素含量明显低于WL下的植物。相反，在高R/FR光照比下，射线花瓣花青素含量显著更高（图1，A和B）。
花青素含量的变化与射线花瓣中几个花青素相关结构基因的表达密切相关，包括CmCHS、CmCHI、CmF3H、CmDFR、CmANS和CmUFGT。与WL处理相比，当开花期的花蕾在低R/FR光照比处理下处理6小时时，这些结构基因的表达水平明显较低，而当植物接受高R/FR光照比处理时，情况恰恰相反（图1C）。
所有花青素结构基因中基因表达水平的伴随变化表明，不同的R/FR光照比通过调节一些常见的上游转录因子影响花青素的积累。CmMYB6和CmbHLH2是两个主要候选者，先前已确定它们可促进菊花花瓣中的花青素积累。为了测试这两种转录因子是否参与光介导的花青素生物合成，我们首先用RT-qPCR检测了不同光照条件下射线花瓣中它们的转录水平，发现低R/FR光照比显著抑制CmbHLH2转录，这与其作为正花青素调节剂的作用一致。然而，在低或高R/FR光比处理下，CmMYB6转录水平没有显著变化（图1D）。
值得注意的是，高R/FR光照比处理（146.84±1.41–191.50±0.94 mmol m–2 s–1）的光合光子通量密度（PPFD）值略高于WL处理（135.29±1.46–173.98±1.20 mmol m-2 s–2）。已知高光强度促进拟南芥中的花青素生物合成。为了排除在高R/FR光照比处理下CmbHLH2在转录水平上的上调是由于光照强度的增强的可能性，我们检测了在两种不同光照强度（175 mmol m–2 s–1对200 mmol m-2 s–2）下“南农芬翠”品种的射线花瓣中CmbHLH的转录。我们发现，光强度的增加在统计学上没有显著影响CmbHLH2的转录（补充图S1B）。
因此，我们得出结论，在高R/FR光比处理下，射线花瓣中花青素含量的增加可能是由于R/FR光比本身的改变，而不是光强度的改变。此外，我们发现，通过蛋白质印迹法测定的CmMYB6和CmbHLH2蛋白稳定性不受短暂转化花的射线花瓣中低或高R/FR光照比的影响（图1E和F），这表明光信号不太可能改变这两种蛋白。总之，不同的R/FR光照比可能通过在菊花中的转录水平调节CmbHLH2来影响花青素的生物合成。
Fig. 1
3.2 低R/FR光照比诱导CmMYB4抑制CmbHLH2并负调控花青素生物合成
为了研究CmbHLH2在不同光照比下如何调节，我们进行了酵母单杂交（Y1H）筛选。分离出长2kb的CmbHLH2启动子，并将其作为诱饵插入pHIS2载体中，鉴定出含有部分CmMYB4 cDNA片段的几个阳性集落。
在射线花瓣中，CmMYB4在低R/FR光照比下显著上调5倍，与花青素含量的降低成反比，表明CmMYB4可能起到花青素生物合成阻遏剂的作用。然而，在高R/FR光照比下，CmMYB4仅轻微下调，但在统计学上显著下调（补充图S2A），这表明CmMYB4可能根据光照条件对花青素生物合成进行不同的调节。为了进一步研究菊花中CmMYB4的功能，我们首先进行了系统发育分析，并发现CmMYB4与AtMYB5最密切相关（补充图S2B），AtMYB是已知的花青素生物合成阻遏物。
CmMYB4定位于烟草叶表皮细胞的细胞核（补充图S2C）。此外，CmMYB4含有保守的EAR基序（LNLELR）（补充图S2D），这是众所周知的转录抑制基序。据报道，亚组4（SG4）R2R3 MYB蛋白通过与bHLH蛋白相互作用来发挥其抑制作用。然而，令我们惊讶的是，我们的酵母双杂交（Y2H）和生物分子荧光互补（BiFC）测定均显示，CmMYB4与MBW复合物成分CmbHLH2没有相互作用（补充图S3，A和B），这表明CmMYB4可能在调节菊花中的花青素生物合成方面发挥不同的作用。在拟南芥中，AtMYB4与三个顺式元件结合，即ACCTACC（AC-I）、ACCAACC（AC-II）和ACCTAAC（AC-III），以抑制靶基因表达。
为了研究CmMYB4是否可以通过类似的机制抑制CmbHLH2的表达，我们首先使用PlantCARE生物信息学预测了2-kb长的CmbHLH2启动子内的两个AC-II元件。为了测试CmMYB4是否在植物中直接结合CmbHLH2的启动子，我们进行了染色质免疫沉淀（ChIP）-PCR测定。我们从稳定过表达的CmMYB4（35S:CmMYB4-GFP）植物的叶片中制备染色质样品（补充图S2E），并用抗GFP抗体进行ChIP，随后的qPCR测定表明，定位在-1737和-1593bp之间的第一个AC-II片段显著富集。然而，第二个AC-II元件（–900 bp至–753bp）与对照（–1328至–1193 bp）相比没有显著富集（图2A），表明CmMYB4可以特异性识别CmbHLH2启动子中的AC-II元素（ACCAACC，–1702至–1695 bp），AC-II元件周围的核苷酸可能在确定结合特异性方面发挥作用。
为了进一步确认CmMYB4与CmbHLH2启动子的结合，我们进行了Y1H测定，我们发现CmMYB4和CmbHLH启动子的共转化使酵母能够在选择性培养基上生长，而空载体与CmbHLH2启动子或CmMYB4与突变的CmbHL启动子（缺少AC-II元件）的共转化未能做到这一点，证实了CmMYB4对AC-II顺式元件的结合特异性（图2B）。
为了在体外进一步证实这一点，进行了电泳迁移率转移试验（EMSA）。将含有AC-II元件的生物素标记探针与亲和纯化的His-CmMYB4融合蛋白孵育。未标记的野生型探针和AC-II元件在浓度增加时突变的探针用作竞争对手。只有当标记的DNA探针与HisCmMYB4混合时，我们才发现移位的条带，这表明该蛋白与AC-II元件结合。相比之下，当单独使用His蛋白时，没有检测到移位带。较高竞争对手浓度下的结合能力降低表明，CmMYB4在体外特异性结合AC-II元件（图2C）。
这些发现表明CmMYB4在CmbHLH2启动子的-1702至-1695bp处与AC-II元件直接结合。为了测试CmMYB4是否在调节花青素生物合成中发挥作用，我们使用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术和含有人工micro-RNA-CmMYB 4（pCVACmMYB-amiR，pCVB用作辅助载体）的改良卷心菜卷曲双子病毒载体（pCVA）沉默了菊花“南农芬翠”品种的花中的CmMY B4。射线花瓣的RT-qPCR分析表明，pCVA-CmMYB4-amiR系中CmMYB4的表达显著降低（补充图S4A）。与空载体对照相比，CmMYB4基因沉默导致射线花瓣中的花青素积累更高（图2，D和E）。相反，当用改良过表达载体pSAK277短暂过表达CmMYB4时（补充图S4A），射线花瓣中积累的花青素量减少了450%（图2、D和E）。
总之，这些结果表明，CmMYB4在体内对射线花瓣中的花青素积累负调控。同时，病毒诱导的CmMYB4沉默和CmMYB4的瞬时过表达分别导致射线花瓣中CmbHLH2的上调和下调（补充图S4，A和B），这表明CmMYB4可能通过调节菊花射线花瓣的CmbHLH2表达水平来调节花青素的积累。一致地，在CmMYB4过表达背景中瞬时过表达CmbHLH2成功地平息了CmMYB4对射线花着色的抑制作用。此外，当CmMYB4和CmbHLH2同时瞬时沉默时，射线花瓣中的花青素含量不能积累到比单独沉默CmMYB4更高的水平（图2、D和E以及补充图S4、a和B），进一步表明CmMYB4和CmbHLH2可能在相同的途径中起作用，并且CmMYB4可能作为上游调节器直接抑制CmbHLH的表达。
Fig. 2
3.3 CmMYB4与CmTPL相互作用以损害CmbHLH2组蛋白H3乙酰化
CmMYB4在C末端具有保守的EAR基序。携带EAR基序的转录因子通过与TPL共抑制因子相互作用抑制下游基因的转录。该阻遏复合物可以通过招募HDAC来修饰靶基因转录起始位点（TSS）处的组蛋白H3乙酰化水平，从而抑制靶基因表达。
为了研究菊花中是否也存在相同的机制，我们首先分析了CmbHLH2组蛋白H3是否可以脱乙酰化。使用针对CmMYB4过表达和敲除（CmMYB4-amiR）植物的瞬时转化花的射线花瓣中的乙酰化组蛋白H3的抗体进行ChIP PCR测定。与对照花（pSAK277空载体）相比，CmMYB4-OE转基因花在CmbHLH2的TSS处表现出组蛋白H3乙酰化降低。相比之下，CmMYB4-amiR转基因花表现出了组蛋白H4乙酰化升高（图3A）。CmMYB4的表达水平与CmbHLH2的H3乙酰化水平之间的负相关表明，CmMYB4可能参与调节CmbHLH的组蛋白H3乙酰水平。
接下来，我们测试了CmMYP4中的EAR基序是否需要抑制CmbHLH2的表达及其H3乙酰基化水平。为此，我们用突变的EAR基序瞬时过表达CmMYB4（从LNLELR到ANAEAR，EAR基阵中的三个亮氨酸被丙氨酸取代）。正如预期的那样，当EAR基序发生突变时，对照和CmMYB4mEAR OE转基因花之间的组蛋白H3乙酰化水平在统计学上没有显著差异（图3A），尽管转基因表达水平增加了五倍以上（补充图S4A）。我们也没有发现瞬时转化花的射线花瓣中CmbHLH2表达水平的任何统计学显著变化（补充图S4B），这表明CmMYB4需要EAR基序作为CmbHLH 2阻遏物发挥作用。
我们先在CmMYB4和CmTPL之间进行了Y2H测定，我们发现CmMYB4与CmTPL相互作用，但当CmMYB4 EAR基序发生突变时，却未能做到这一点（图3C），这证实了CmMYP4与Cm TPL相互作用需要EAR基序。
为了测试CmTPL和CmMYB4是否在植物体内相互作用，进行了BiFC测定。在BiFC测定中，通过渗透，全长CmMYB4和CmTPL分别在烟草叶片中瞬时表达为增强黄色荧光蛋白的N-和C-半部的融合蛋白。在细胞核中观察到重构的荧光信号，并与核标记物mRFP NLS的信号融合，而全长突变的CmMYB4mEAR和CmTPL没有重构荧光信号，尽管核标记物荧光信号很容易检测到（图3E）。这些体外和体内实验证实了CmMYB4和CmTPL在细胞核中的特异性相互作用，这取决于EAR基序。
Fig. 3
3.4 在高R/FR光照比处理下，CmMYB4对花青素的积累起次要作用
迄今为止，我们已经证明，CmMYB4通过下调CmbHLH2表达水平，在低R/FR光照比下抑制花青素的生物合成。然而，它是否参与高R/FR光照比下的花青素生物合成调控仍不清楚。
如果CmMYB4在调节菊花瓣花青素积累中起主要作用，那么在高R/FR光照比处理下，它将被显著下调。然而，当光线花瓣中的花青素积累在高R/FR光照比处理下显著增加时，CmMYB4仅略低，但在统计学上显著下调（图1B和补充图S2A），这表明CmMYB4可能在高R/RR光照比下在调节花青素生物合成中起次要作用。
为了进一步证实这一点，我们在菊花射线花瓣中瞬时过表达CmMYB4，并对渗透的植物进行高R/FR光照比处理。我们发现，即使CmMYB4的表达水平增加了五倍，但CmbHLH2的表达受到轻微抑制，射线花瓣中的花青素含量仅降低了15%（图4，A–D）。然而，这与WL下CmMYB4的过度表达形成了对比，后者将花青素含量和CmbHLH2表达分别降低了460%和70%（图4，C和D），这表明高R/FR光照比显著损害了CmMYB4的功能。一种可能的解释是，即使转录物表达水平很高，CmMYB4蛋白在高R/FR光照比下仍不成比例地降解。
为了测试这一点，进行了蛋白质稳定性测定，以检查不同的R/FR光照比是否会对CmMYB4蛋白质稳定性产生不同的影响。35S:CmMYB4旗瞬时转化的“南农芬翠”品种扦插苗分别在WL、低R/FR光照比和高R/FR光照比下处理不同时间。用抗Flag抗体提取渗入的扦插苗叶片中的总蛋白进行western印迹分析，我们发现，与WL处理相比，低或高R/FR光照比均未显著影响CmMYB4蛋白稳定性（图4，E和F），表明CmMYB4蛋白稳定性不太可能导致不同光照条件下花青素积累模式的差异。由于CmMYB4对花青素生物合成的抑制也需要CmTPL，我们推测高R/FR光照比可能削弱了CmTPL的表达水平，从而损害了CmMYB4–CmTPI复合物的形成，导致射线花瓣中花青素的积累更高。然而，射线花瓣中的基因表达分析表明，CmTPL表达模式在不同的光照处理中没有显著变化（图4G），这表明CmTPL不太可能是菊花射线花瓣花青素积累减少的主要原因。
Fig. 4
3.5 CmbHLH16与CmMYB4相互作用以破坏CmMYB4–CmTPL蛋白复合物的稳定性
因为CmMYB4和CmTPL转录水平均不受高R/FR光照比的显著影响；因此，我们假设额外的相互作用伙伴可能通过破坏CmMYB4–CmTPL蛋白复合物的形成而参与花青素调节，或者，高R/FR光照比可能触发另一种未知的花青素生物合成激活剂，其独立于CmMYB4–Cm TPL模块。
为了区分这些可能性，我们首先建立了以CmMYB4为诱饵的Y2H筛选方法来鉴定这种推定的蛋白质相互作用伴侣。我们获得的几个菌落中的一个含有CmbHLH16基因的部分cDNA片段。CmbHLH16与PtPIF8a最密切相关，含有保守的活性APB基序（补充图S5，a和B）。
在射线花瓣中，CmbHLH16被高R/FR光比显著上调，而被低R/FR光比显著下调（图5A），与不同光照条件下花青素含量的变化正相关（图1B）。此外，CmbHLH16没有直接调节花青素相关结构基因，如Y1H分析所揭示的（补充图S6），这表明CmbHLH26可能与CmMYB4相互作用，以响应不同的R/FR光照比微调花青素积累。
Y2H分析表明，CmMYB4与CmbHLH16相互作用，但CmTPL不相互作用（图5B）。体外pull down试验进一步验证了CmMYB4和CmbHLH16之间的相互作用（图5C）。BiFC分析表明，CmbHLH16与烟草叶片细胞核中的CmMYB4相互作用，但也与CmTPL相互作用（图5D）。CmMYB4在N端携带R2R3结构域，在C端携带EAR基序，我们发现这两个结构域都可以与CmbHLH16相互作用（补充图S7）。总之，我们的结果表明，在菊花中，CmbHLH16可能与CmTPL特异性地竞争与CmMYB4的结合。为了直接测试CmTPL和CmbHLH16对CmMYB4的竞争性结合，进行了酵母三杂交（Y3H）测定，其中CmbHLH26转录由Met可抑制的pMET25启动子调节。在甲硫氨酸缺乏的条件下，CmbHLH16极大地抑制了CmMYB4–CmTPL异二聚化，如酵母菌落存活所示（图5E）。然后，我们在下拉实验中测试了三种蛋白质的竞争结合能力。GST-CmTPL和His-CmMYB4与增加量的His-CmbHLH16一起孵育。用抗GST抗体沉淀显示CmTPL的量逐渐减少（图5F），进一步支持CmbHLH26干扰CmMYB4–CmTPP蛋白复合物的形成。
Fig. 5
3.6 CmbHLH16微调花青素生物合成以响应不同的R/FR光照比
为了研究CmbHLH16是否可以通过破坏CmMYB4–CmTPL蛋白复合物的稳定性来促进CmbHLH2的表达，在本氏猪笼草叶片中进行了双重LUC测定。我们发现，与对照组（空pORE-R4质粒与pCmbHLH2:LUC共浸润）相比，35S:CmMYB4与pCmbHLH2:LUC的共表达显著降低了LUC:REN比率。
然而，当35S:CmMYB4与35S:MmHLH16共表达时，降低的LUC:REN比率部分恢复（图6A），表明增加的CmHLH1可以减弱CmMYB4对CmHLH2启动子活性的抑制，这与我们的假设一致。
Y1H分析表明，CmbHLH16不直接调节CmbHLH2，因为共表达pHIS2-CmbHLH2pro和pGADT7-CmbHLH16的酵母细胞不能在所选培养基上生长（图6B）。此外，我们发现在CmMYB4 amiR瞬时转化的扦插苗的叶片中，WL下CmbHLH16的过度表达不会进一步显著促进CmbHLH2的表达（补充图S8）。
这些表明，CmbHLH16可能通过破坏CmMYB4–CmTPL蛋白复合物的形成而不是直接激活CmbHLH2基因表达来促进CmbHLH启动子的转录活性。为了进一步证实这一点，我们在菊花中瞬时过表达CmbHLH16，这导致在WL和低R/FR光照比条件下，射线花瓣中CmbHLH2和花青素积累的表达水平更高（图6C和D）。此外，当CmbHLH16在高R/FR光照比下被敲低时，CmbHLH2也被下调，导致射线花瓣中花青素的积累降低（图6、C和D以及补充图S9、A和B）。这些结果表明，CmbHLH16微调花青素生物合成以响应不同的R/FR光照比。
Fig. 6
04
结论
在高R/FR光照比环境下，CmbHLH16表达升高，CmbHLH16的积累导致与CmTPL直接竞争结合CmMYB4，因此，破坏CmMYB4–CmTPL抑制复合物的稳定性并释放对CmbHLH2的抑制，导致射线花瓣中的花青素积累增加（图7）。结果不仅提供了对光调节花青素生物合成的分子机制的更好理解，而且为提高植物观赏性状的质量提供了一种手段。
Fig. 7
05
获取原文
原文链接：
https://academic.oup.com/plphys/article-abstract/190/2/1134/6649708?redirectedFrom=fulltext
PDF获取：
https://www.scientsgene.com/h-nd-124.html#_np=107_423
文末附件。
END
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