文章信息
题目：pHBMT1, a BAHD-family monolignol acyltransferase, mediates lignin acylation in poplar
刊名：Plant Physiology
作者：Lisanne de Vries，Shawn D Mansfield et al.
单位：University of British Columbia
日期：22 November 2021
01
摘要
杨树 ( Populus ) 木质素被对羟基苯甲酸酯部分自然酰化。然而，参与单木质醇-对羟基苯甲酸酯生物合成的酶在很大程度上仍是未知的。在这里，我们使用小麦胚芽细胞无细胞翻译系统对毛果杨BAHD 酰基转移酶超家族（116 个基因）进行了体外筛选，发现了五种能够产生木酚醇-对羟基苯甲酸酯的酶。然后，我们使用天然存在的毛果单胞菌基因型将五个相应基因的转录本丰度与对羟基苯甲酸浓度进行比较并揭示了对羟基苯甲酰基-CoA 单糖醇转移酶 (pHBMT1, Potri.001G448000) 的表达与对羟基苯甲酸酯水平呈正相关。为了测试pHBMT1是否负责单木酚-对羟基苯甲酸酯的生物合成，我们在杂交杨树 ( Populus alba × P. grandidentata ) ( 35S::pHBMT1和C4H::pHBMT1 ) 中过表达pHBMT1。使用三种互补的分析方法，我们发现可溶性木质素单体-对羟基苯甲酸酯和细胞壁结合的木质素单体-p杨树转基因中的羟基苯甲酸酯。由于这些侧基是酯连接的，皂化作用会释放出对羟基苯甲酸酯，它是用于药物和化妆品的对羟基苯甲酸酯的前体。因此，这一鉴定的基因可用于设计木质纤维素生物质，为新兴的生物精炼战略增加价值。
02
技术路线
候选 BAHD 的鉴定和基因合成
共表达分析
P. trichocarpa集合中的基因表达
合成p HBMTs的体外活性筛选
转基因 P39 杂种杨树的转化、生长和选择
植物在 20°C-26°C 的深红/白到低蓝光和深红/白到中蓝光光照下生长
RT-qPCR 技术确定 4 个月大的杨树过表达系发育中的木质部组织中的相对转录水平
木质部中甲醇可溶性p HBA 的分析
DFRC 确定pHB 缀合物与木质素的结合
核磁共振
Klason 木质素含量
03
主要结果
3.1 从毛果杨中鉴定假定的pHBMT
通过与已知的PMT和阿魏酰CoA单信号转氨酶进行类比，pHBMT有望成为CoA依赖性转氨酶Pfam 02458家族（BAHD酶家族）的一部分。在121个基因中，成功合成了116个BAHD酰基转移酶基因，并将其并入用于小麦胚芽无细胞蛋白合成的质粒中。使用所有单独的质粒进行无细胞蛋白质翻译，将翻译反应合并为10组，并用三种单ignol酰基受体（对香豆素醇、针叶醇和辛纳醇）筛选对5种酰基供体底物（对香豆酰基-CoA、阿魏酰基CoA、对羟基苯甲酰基-CaA、苯甲酰CoA和乙酰基CoA）的活性。然后，在单独的酶测定中重新检查与一个或多个供体的活性呈阳性的酶池。在所测试的116个反应中，7个与所测试的底物显示出反应性，只有5个与pHBMT酶的假定底物对羟基苯甲酰基-CoA显示出体外活性（图2）。
此外，在5种假定的pHMBT中，只有一种仅对对羟基苯甲酰基-CoA表现出活性，而其他的也对乙酰辅酶A、苯甲酰辅酶A，对香豆素酰辅酶A和阿魏酰基辅酶A表现出一定的体外活性（图2）。这5个基因都聚集在一个分支中（补充图S1）。
Fig. 2
3.2 毛果杨中pHB浓度的自然变化
通过高效液相色谱法（HPLC）在无提取物木粉的碱性水解后测定了4年生田间种植的毛果杨的木质部pHB浓度，该树代表了跨越该物种自然范围的316个不相关基因型。pHB含量范围为0.20 mg pHB/g木质部组织（基因型：KLND20-2）至9.1 mg pHB/g木质部（基因型为QLKE16-3；图3）。
Fig. 3
我们用内部的木质部组织RNA测序（RNA-seq）数据库中确定的pHB含量和五种假定的pHBMT的基因表达进行了Spearman相关性分析。这清楚地表明，001G44800与pHB水平呈显著正相关（图4）。001G448000是五个候选者中唯一一个在杨树节间组织中表现出比成熟叶组织更高的表达，并且在发育中的木质部中表现出最高的表达。001G448000也是与其他候选基因差异最大的（补充图S1），该基因也与几个核心木质素生物合成基因共同表达（补充图S2和补充表S1）。
总而言之，001G448000（以下表示为pHBMT1）被确定为最有希望的候选基因，因此通过在杨树中过度表达该基因，用于进一步的体外酶活性测定和植物内分析。
Fig. 4
3.3 pHBMT1的体外活性
以乙酰辅酶A、对香豆素酰辅酶A，阿魏酰辅酶a、苯甲酰辅酶a和对羟基苯甲酰基辅酶a作为酰基供体，以三种木质素单体作为酰基受体（对香豆醇、香豆素醇和辛那醇），测试pHBMT1的活性。基于液相色谱-质谱（LC-MS）分析和与真实标准品的比较，仅在木质素单体和对羟基苯甲酰基-CoA之间的反应中观察到预期的共轭产物（光谱补充图S3）。
当提供所有三种单甘醇时，pHBMT1对辛那普利醇比对香豆醇有强烈的偏好，并且对对香豆素醇没有表现出任何活性。酶动力学分析证实了这些观察结果（表1）。当将pHBMT1的动力学与其他已知的BAHD酰基转移酶的动力学进行比较时，在pHBMT2、FMT和PMT之间没有观察到明显的趋势，例如，它们都是使用单信号醇作为底物的BAHD-酰基转酶。
Table 1
3.4 杂交杨中pHBMT1的过度表达不影响植物生物量
为了测试pHBMT1的表达是否能够驱动植物中的pHB产生，在杂交杨（白杨×大白杨P39）中，使用两个强启动子35S:：pHBMT2和C4H:：phbMT3表达合成基因（Potri.001G448000，密码子为基因合成而改变）。对于这两种转化，最初选择了12个独立的转化体，并将每个构建体的三个最高表达系（组织培养生长）转移到温室中进行生长和深入分析。
与野生型（WT）树木相比，在生长4个月后，对根领上方茎基部的高度（cm）和直径（mm）的检查未发现转基因系的生长模式发生任何变化（图5，A-C）。然后收获4个月大的树，并使用RT-qPCR确认发育中的木质部中pHBMT1的表达（图5D）。
Fig. 5
3.5 pHBMT1细胞系中pHB含量增加
收获后，我们测定了不同转基因杨树系细胞壁中pHB的量。对各品系的木质部组织进行甲醇提取，随后进行碱性水解，以确定可溶性pHBA的总量。然后将剩余的细胞壁残留物用丙酮洗涤并进行碱性水解以测定细胞壁结合的pHB的量。这些样品的HPLC分析显示，在所有三个35S：：pHBMT1系中，可溶性pHBA含量显著增加（80%–270%），细胞壁结合的pHB也显著增加（55%–70%）（图6）。相反，只有表达最高的C4H:：pHBMT1系（系9）显示可溶性和细胞壁结合的pHB显著增加（图6）。
Fig. 6
然后使用衍生化和还原裂解法（DFRC）来测定从木质素释放的单体木质素–pHB缀合物的相对水平。由于该方法仅裂解β-醚键，而保留酯键完整，因此DFRC可用于量化木质素中S-pHB的相对含量。我们观察到35S：：pHBMT1品系15和35S：pHBMT1品系18的S-pHB释放量显著增加（分别增加30%和20%，图7），C4H：：pHBMT1品体系9的S-pHB释放量增加50%（图7）。
Fig. 7
最后，使用核磁共振（NMR）来验证这些发现，并评估木质素成分或结构是否有其他变化。与相应的WT系（5.8%；图8）相比，35S：：pHBMT1线15（7.2%）和C4H：：pHBMT1线9（7.9%）中对应于pHB的信号的相对强度增加。
Fig. 8
在S/G单体比或单元间键的比例方面没有观察到差异（表2）。为了研究pHB水平的增加是否对细胞壁中沉积的木质素的量有影响，还完成了Klason木质素分析。WT样品与不同的35S：：pHBMT1或C4H：：pHBMT1转基因系之间未观察到显著差异（表2）。
Table 2
总之，我们清楚地看到，在许多转基因系中，木质素中的pHB基团增加和/或可溶性pHB量增加，而对总细胞壁木质素含量没有影响。这些发现表明，pHBMT1确实通过将对羟基苯甲酰基-CoA与单木质素偶联而参与单木质素–pHB缀合物的合成。
04
结论
在这项研究中，我们描述了一种对羟基苯甲酰辅酶A 单木酚转移酶 ( pHBMT )，它是杨树 BAHD 酰基转移酶基因家族的成员，它负责单木酚- p HB 偶联物的形成（图 1B）。为了测试pHBMT是否最终导致杨树木质素的对羟基苯甲酰化，我们在杂种杨树中过表达了该基因。这导致细胞壁中pHB水平增加，但对生物质含量或木质素浓度没有影响。
因此，在未来，pHBA可能是木质素第一生物精炼厂的高价值副产品，在该生物精炼厂中，通过工程木质素聚合物的水解反应，从而使木质纤维素生物质具有更高的价值，并最终提高可再生生物质替代能源的经济性。
Fig. 1
05
获取原文
原文链接：
https://academic.oup.com/plphys/article/188/2/1014/6433171?searchresult=1
END
06
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